【摘要】：丙型肝炎病毒是一種能引起重大肝臟類疾病的RNA病毒,嚴(yán)重威脅著人類的健康安全。病毒本身的遺傳多變性導(dǎo)致了有效疫苗的研發(fā)困難,另外傳統(tǒng)的藥物治療如干擾素治療方法以及直接作用抗病毒藥物面臨治療并發(fā)癥、特定分型治療差、部分病例難治愈以及成本高昂等問題。在這樣的背景下,本研究針對(duì)HCV制備了一種新型的特異性親和吸附劑。第一部分介紹了HCV病毒的分子生物學(xué)、遺傳特征、治療策略等基本情況,其次也對(duì)體外血液凈化治療的原理、分類、吸附劑載體、配體等方面進(jìn)行了概括。其次,我們使用不同的交聯(lián)方法制備親和吸附劑并比較了包括偶聯(lián)率、操作難易、安全環(huán)保、配體結(jié)合穩(wěn)定性等方面,最終擇優(yōu)選取羧基化瓊脂糖凝膠微球作為固相載體,EDC、NHS為交聯(lián)劑并經(jīng)過工藝優(yōu)化制備了偶聯(lián)率達(dá)91%的親和吸附劑。隨后對(duì)制備而成的親和吸附劑進(jìn)行電鏡表征以及紅外表征,驗(yàn)證功能配體成功偶聯(lián)于固相載體之上。另外,我們研究了親和吸附劑的生物相容性以及血液安全性,通過非特異性吸附、全血接觸實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一點(diǎn)。我們進(jìn)一步對(duì)親和吸附劑的病毒吸附性能進(jìn)行了考察,首先通過批量吸附實(shí)驗(yàn),使用熒光定量PCR驗(yàn)證了親和吸附劑對(duì)體外培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增的HCV的清除功效,其對(duì)病毒的清除率大約為89%,隨后對(duì)親和吸附劑清除病毒的時(shí)間特性進(jìn)行了考察,熒光定量PCR技術(shù)以及Southern雜交等實(shí)驗(yàn)表明在2h內(nèi)親和吸附劑對(duì)目標(biāo)樣本的HCV清除率可達(dá)到85%以上。其次我們使用病人樣本作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象對(duì)親和吸附劑的病毒清除性能再次進(jìn)行驗(yàn)證,最后我們探討了不同的滅菌工藝對(duì)親和吸附劑的性能回復(fù)率影響。綜上所述,我們使用功能核酸作為配體使用合適的方法成功制備了血液安全性良好的HCV特異性親和吸附劑,其物理化學(xué)結(jié)構(gòu)得到表征驗(yàn)證,同時(shí)其對(duì)體外培養(yǎng)系統(tǒng)或者病人樣本HCV都具備良好的清除功效,應(yīng)用之前合適的滅菌方法也得到確認(rèn),有望成為新型的HCV治療策略。
[Abstract]:Hepatitis C virus (HCV) is a kind of RNA virus which can cause major liver diseases. It is a serious threat to human health and safety. The genetic variability of the virus itself makes it difficult to develop effective vaccines. In addition, traditional drug treatments, such as interferon treatment and direct antiviral drugs, face treatment complications, and specific types of treatment are poor. Some cases are difficult to cure and costly. In this context, a novel specific affinity adsorbent was prepared for HCV. In the first part, the molecular biology, genetic characteristics and therapeutic strategies of HCV virus were introduced. Secondly, the principle, classification, adsorbent carrier and ligand of in vitro blood purification therapy were also summarized. Secondly, we used different crosslinking methods to prepare affinity adsorbents and compared the coupling ratio, easy operation, safety and environmental protection, ligand binding stability and so on. Finally, carboxylated agarose gel microspheres were selected as solid phase carrier, EDC,. The affinity adsorbent with coupling efficiency of 91% was prepared by using NHS as crosslinking agent and optimized process. The affinity adsorbents were characterized by electron microscopy and IR, and the functional ligands were successfully coupled to the solid phase carrier. In addition, we studied the biocompatibility and blood safety of affinity adsorbent, which was verified by non-specific adsorption, whole blood contact test and cytotoxicity test. We further investigated the viral adsorption properties of affinity adsorbents. Firstly, batch adsorption experiments were carried out to verify the scavenging effect of affinity adsorbents on HCV amplified by culture system in vitro by using fluorescent quantitative PCR. The virus clearance rate was about 89%, and then the time characteristics of the affinity adsorbent to remove the virus were investigated. The results of fluorescence quantitative PCR and Southern hybridization showed that the HCV clearance rate of the affinity adsorbent to the target sample could reach more than 85% within 2 hours. Secondly, we used patient samples as experimental objects to verify the virus clearance performance of affinity adsorbent. Finally, we discussed the effect of different sterilization processes on the performance recovery rate of affinity adsorbent. In conclusion, we used functional nucleic acids as ligands to successfully prepare HCV specific affinity adsorbents with good blood safety, and their physical and chemical structures were characterized and verified. At the same time, it has good scavenging effect on in vitro culture system or HCV of patient sample, and the proper sterilization method before application is confirmed, which is expected to be a new treatment strategy for HCV.
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943

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