【摘要】：本試驗旨在建立體外雞黑素皮質(zhì)素受體-4(cMC4R)反向激動劑的細胞篩選模型,為從中草藥中篩選出能與cMC4R作用且存在活性的中藥成分提供一些基礎(chǔ)性的研究。將成功構(gòu)建的cMC4R真核表達質(zhì)粒cMC4RpcDNA3.1(+)-myc與報告基因質(zhì)粒pGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]按1∶5的比例共轉(zhuǎn)染到CHO-K1細胞,兩周后經(jīng)有限稀釋法獲得單克隆;將獲得的單克隆分別用CRE激活劑Forskolin和MC4R激動劑NDP-MSH作用6h,挑選螢火蟲熒光素酶的相對表達量最高的單克隆作為陽性細胞株;提取陽性細胞總RNA,RT-PCR檢測陽性細胞內(nèi)cMC4R基因、熒光素酶報告基因的轉(zhuǎn)錄水平;對MC4R激動劑NDP-MSH的終濃度、NDP-MSH孵育時間及溶劑DMSO的終濃度進行優(yōu)化,應(yīng)用Z’因子對篩選方法進行評估。結(jié)果顯示,獲得了5個單克隆(A2、F7、F8、F9、H10),其中單克隆A2的螢火蟲熒光素酶的相對表達量最高,將其作為陽性細胞株;RT-PCR在預(yù)期位置擴增出大小分別為996和1 653bp的兩條目的條帶;激動劑NDP-MSH終濃度為10-9 mol/L、NDP-MSH孵育時間為8h、溶劑DMSO終濃度小于2%時,篩選模型Z’因子為0.82。結(jié)果表明,本試驗所建立的篩選方法可靠、穩(wěn)定,細胞篩選模型可用于cMC4R反向激動劑的篩選,為進一步從中藥中篩選出有效物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The aim of this study was to establish a cell screening model of chicken melanin receptor 4 (cMC4R) reverse agonist in vitro, and to provide some basic research for the screening of active components of traditional Chinese medicine which can interact with cMC4R from Chinese herbal medicine. The successfully constructed cMC4R eukaryotic expression plasmid cMC4RpcDNA3.1 ()-myc and reporter gene plasmid pGL4.29 [luc2p/CRE/Hygro] were co-transfected into CHO-K1 cells at 1:5 ratio. The obtained monoclonal cells were treated with CRE activator Forskolin and MC4R agonist NDP-MSH for 6 h, and the highest relative expression of luciferase was selected as the positive cell line. Total RNA,RT-PCR was extracted from positive cells to detect the transcription level of cMC4R gene and luciferase reporter gene. The final concentration of MC4R agonist NDP-MSH, the incubation time of NDP-MSH and the final concentration of solvent DMSO were optimized. Z' factor was used to evaluate the screening method. The results showed that five Monoclonal (A2OF7F8F8F9H10) were obtained, among which the relative expression of luciferase of Monoclonal A2 was the highest, and it was regarded as a positive cell line. The RT-PCR amplified the bands of 996 and 1 653bp items in the expected position. When the final concentration of agonist NDP-MSH was 10-9 mol/L,NDP-MSH, the incubation time was 8h, and the final concentration of solvent DMSO was less than 2, the screening model Z' factor was 0.82. The results showed that the screening method was reliable and stable, and the cell screening model could be used for the screening of cMC4R reverse agonists, which laid a foundation for the further screening of effective substances from traditional Chinese medicine.
【作者單位】： 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院;江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心;
【基金】：江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(PAPD) 教育部第46批“留學(xué)回國人員科研啟動基金”
【分類號】：R965.1

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