【摘要】：過氧化物酶體增殖物激活受體y (PPARy)屬于核受體超家族成員,是一種配體激活型轉錄因子,在糖脂代謝、炎癥和癌癥中起著關鍵作用。在人體脂肪組織細胞,巨噬細胞及肝、肺等脂肪貯存細胞中均有不同程度的PPARy表達活性。當有配體存在時,被激活的PPARy可以發(fā)揮促進脂肪細胞的生成和分化,緩解胰島素抵抗,負向調控炎癥反應,調節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及延緩組織器官纖維化等作用,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展都有著密切的關系。隨著高通量藥物篩選技術的不斷發(fā)展,基于靶點或者靶信號的藥物篩選逐步成為藥物研發(fā)的最有效方式之一。因此,構建一種基于PPARy信號通路的高通量藥物篩選模型,并應用于PPARy激動劑的篩選,將會為心血管相關疾病的治療提供更多的候選藥物,開拓疾病治療的新途徑。本課題構建了一種基于PPARy信號通路的高通量藥物篩選模型,并將其應用于天然單體化合物的篩選,同時對得到的先導化合物做了初步探究。我們通過擇優(yōu)選擇PPARy組成型活化細胞,并對PPARy響應元件PPRE比例進行多次調整,最終得到藥物篩選模型細胞CLPPD。該模型以Chang Liver為宿主細胞,以熒光素酶為報告基因,含有23個PPRE重復序列的響應元件及完整PPARy表達元件。通過DNA測序、Western-Blot實驗及傳代實驗證實該細胞模型成功插入目的元件并穩(wěn)定性良好,能夠應用于PPARy激動劑的篩選。隨后我們篩選了2500余種天然單體化合物,復篩得到了5種有信號激活作用的先導化合物,其中以15#化合物作用最佳。通過MTT方法及熒光活性檢測,我們發(fā)現(xiàn)15#化合物細胞毒性小,且相比于對照在15μM處理濃度下有2倍的PPARy激活作用。Western-Blot實驗及半定量RT-PCR實驗進一步證實,15#化合物可提高PPARy在CLPPD細胞和THP-1細胞中的表達活性。綜上所述,我們成功構建了一種PPARy激動劑的高通量篩選模型,并將其應用于2500余種天然產物的篩選,最終得到5種先導化合物,進一步研究發(fā)現(xiàn)15#化合物能顯著激活PPARy,并促進PPARy的表達,為進一步篩選得到PPARy激動劑,尋找心血管疾病靶向藥物提供了一定的技術和理論依據(jù)。
[Abstract]:Peroxisome proliferator activated receptor (y (PPARy), a member of nuclear receptor superfamily, is a ligand activated transcription factor, which plays a key role in glycolipid metabolism, inflammation and cancer. In human adipose tissue cells, macrophages, liver, lung and other fat storage cells have different degrees of PPARy expression activity. In the presence of ligands, activated PPARy can promote adipocyte formation and differentiation, alleviate insulin resistance, negatively regulate inflammatory response, regulate tumorigenesis and progression, and delay fibrosis of tissues and organs. It is closely related to the occurrence and development of many diseases. With the development of high throughput drug screening technology, drug screening based on target or target signal has gradually become one of the most effective methods of drug development. Therefore, the establishment of a high-throughput drug screening model based on PPARy signaling pathway and its application to the screening of PPARy agonists will provide more candidate drugs for the treatment of cardiovascular diseases and open up new approaches to the treatment of cardiovascular diseases. In this paper, a high throughput drug screening model based on PPARy signaling pathway was constructed and applied to the screening of natural monomers. We selected the PPARy constitutive activated cells selectively, and adjusted the PPRE ratio of PPARy response elements many times. Finally, we obtained the drug screening model cells CLPPD.. The model uses Chang Liver as host cell and luciferase as reporter gene. It contains 23 response elements of PPRE repeat sequence and complete PPARy expression element. The DNA sequencing, Western-Blot and passage experiments confirmed that the cell model was successfully inserted into the target element and stable, and could be applied to the screening of PPARy agonists. Then we screened more than 2500 natural monomers and obtained five leading compounds with signal-activated activity, of which 15# was the best. By MTT method and fluorescence assay, we found that the cytotoxicity of 15# compound was less than that of the control, and the activity of PPARy was twice as much as that of the control at the concentration of 15 渭 M. Western-Blot and semi-quantitative RT-PCR experiments further confirmed the cytotoxicity of 15# compound. Compound 15# could increase the activity of PPARy expression in CLPPD cells and THP-1 cells. To sum up, we successfully constructed a high-throughput screening model for PPARy agonists, and applied it to the screening of more than 2500 natural products. Finally, five leading compounds were obtained. Further studies showed that 15# compounds could significantly activate PPARy,. It can also promote the expression of PPARy and provide some technical and theoretical basis for the further screening of PPARy agonists and the search for targeted drugs for cardiovascular diseases.
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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