【摘要】：全球癌癥發(fā)病率居高不下,癌癥作為一種惡性疾病嚴重威脅著人類健康。作為如今腫瘤的主要治療方法之一的化療法,其治療效果受到腫瘤細胞的多藥耐藥作用的限制。因此,開發(fā)抗癌活性高,并且能夠抗癌細胞多藥耐藥的抗腫瘤藥物成為了抗腫瘤藥物的研究熱點。本課題針對Telekin的抗腫瘤多藥耐藥作用及其機制展開相關研究工作,所用到的研究對象-化合物Telekin是從天然植物金挖耳中提取的一種桉烷內酯類化合物,在前期實驗中已經發(fā)現其具有良好的抗腫瘤活性�；谇捌赥elekin抗腫瘤機制的研究結果,本論文發(fā)現其對多藥耐藥的癌細胞也有抑制作用并進一步展開機制探討工作。我們選取了三組耐藥及其親本細胞株K562、K562/A02,KB、KB/VCR,MCF-7、MCF-7/ADR進行藥物敏感性篩選。MTT結果顯示,Telekin對于多藥耐藥細胞具有直接的較強毒性,與傳統化療藥物長春新堿,阿霉素等相比具有不受耐藥泵影響的優(yōu)勢,且對K562/A02及K562細胞的藥物敏感性高于其他兩對組織來源的細胞株,對K562/A02及K562的細胞增殖抑制作用呈現出時間及濃度的依賴性。采用Annexin V/PI雙染法以及DAPI染色對經Telekin處理48h后的K562/A02及K562細胞進行調亡檢測。結果顯示,Telekin對K562/A02及K562具有都誘導細胞調亡的作用,Western Blot對凋亡相關蛋白Bc1-2家族以及Caspase家族蛋白的表達量進行檢測后,我們發(fā)現在Telekin的作用下,K562/A02細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量降低,凋亡促進蛋白Bax表達量升高;未活化的Caspase-9和Caspase-3蛋白的表達量降低,同時其活化形式的Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3的表達量明顯增加,并呈現出濃度依賴性。以上結果表明,Telekin可能通過調節(jié)Bcl-2家族及Caspase家族蛋白表達,誘導K562/A02細胞凋亡。在后續(xù)實驗中,我們主要對Telekin抗多藥耐藥的作用機制進行相關研究。由于P-gp泵對藥物的外排被認為是引起腫瘤細胞多藥耐藥作用的主要因素之一。我們首先采用Rhl23及阿霉素在細胞內的累積實驗對Telekin處理的K562/A02細胞中的P-gp進行探究。流式細胞儀分析結果說明,經非毒性劑量Telekin處理的K562/A02細胞內的Rhl23及阿霉素積累量無明顯增加,Telekin(10 μmol/L,20μmol/L)處理的K562/A02細胞內Rhl23及阿霉素累積量有明顯增加。由此,我們推測,Telekin可能不是通過增加化療藥物的細胞內含量,而是直接誘導耐藥細胞凋亡,由于在毒性劑量下Telekin抑制耐藥細胞中P-gp蛋白的表達,從而引起P-gp泵功能的下調。進而,我們對Telekin抑制P-gp轉錄和蛋白表達做進一步的探討。我們用流式細胞儀,Western Blot及實時定量PCR對P-gp蛋白表達量進行檢測,實驗結果表明經不同濃度Telekin處理的K562/A02細胞中P-gp的蛋白表達及轉錄水平均明顯降低,且呈現出濃度依賴性。我們也針對Telekin對另外兩種與多藥耐藥相關的蛋白MRP-1以及ABCG2的影響進行了探究。由于ABCG2在乳腺癌耐藥細胞株中呈現高表達,故我們選用人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/A及其親本細胞株MCF-7,針對Telekin對細胞中ABCG2的作用進行研究。流式細胞儀和實時定量PCR結果顯示,Telekin能夠抑制K562/A02細胞中MRP-1蛋白的表達量以及其轉錄水平的表達,并呈現濃度依賴性。米托蒽醌累積實驗結果表明,經高濃度(20 μmol/L)Telekin處理的MCF-7/A細胞內米托蒽醌的累積量顯著增加,并呈現出濃度依賴性。我們進一步對ABCG2蛋白的表達進行檢測。Western Blot以及RT-PCR實驗結果表明,經不同濃度Telekin處理的MCF-7/A細胞中ABCG2的蛋白表達及轉錄水平均明顯降低,且呈現出濃度依賴性。綜合實驗結果,我們推測,Telekin也抑制耐藥細胞中MRP-1及ABCG2蛋白水平及轉錄水平的表達。由于P-gp的編碼基因MDR1啟動子核心區(qū)域存在能夠與NF-κB相結合的特異性區(qū)域,ABCG2的啟動子能夠與NF-κB的p50亞基結合。NF-κB通路的活化能夠上調P-gp及ABCG2蛋白的表達,最終引起腫瘤細胞多藥耐藥作用,故我們主要針對AKT/NF-κB信號通路對P-gp及ABCG2蛋白表達的調控進行了進一步探究。Western Blot檢測結果表明,在Telekin處理的K562/A02及MCF-7/A細胞中phospho-AKT與NF-κB表達量明顯降低,I-κB的表達量升高。Telekin能夠通過調節(jié)AKT/NF-κB信號通路,并且對其細胞中高表達的多藥耐藥作用相關蛋白P-gp、ABCG2的表達具有抑制作用。綜上所述,Telekin能夠繞過多藥耐藥細胞中P-gp耐藥泵的作用,并下調多種多藥耐藥泵的轉錄和蛋白表達直接誘導多藥耐藥細胞凋亡,是一個具有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤多藥耐藥的天然產物,我們的研究也為其今后的進一步開發(fā)與臨床應用提供了有價值的實驗數據。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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