【摘要】：背景和目的多藥耐藥性(Multidrug resistance, MDR)是指對(duì)一種藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí),對(duì)其它結(jié)構(gòu)不同,作用靶點(diǎn)不同的藥物也產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象。ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)體B亞家族成員1)的高表達(dá)是MDR產(chǎn)生的根本原因之一。紫杉醇(ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體底物)聯(lián)合鉑類藥物是晚期卵巢癌患者的一線化療方案。但卵巢癌患者多因MDR的產(chǎn)生,導(dǎo)致化療失敗。大量研究報(bào)道卵巢癌患者中ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的異常高表達(dá)與患者化療療效及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。因此,逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的卵巢癌化療的MDR具有重要的臨床意義和緊迫性。以ABCB1為靶點(diǎn),合成或?qū)ふ移湟种苿?通過(guò)抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的外排功能或(和)其在腫瘤細(xì)胞的高表達(dá),可逆轉(zhuǎn)ABCB1介導(dǎo)的MDR。近年來(lái),大量ABCB1抑制劑被發(fā)現(xiàn),個(gè)別甚至已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。但這些ABCB1抑制劑因毒副作用過(guò)大或體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程不明確等原因而研發(fā)失敗。因此,從無(wú)以上局限性的已上市藥物中,尋找一種可顯著抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的藥物,作為ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的MDR逆轉(zhuǎn)劑進(jìn)行開發(fā),可能是一種更好的解決策略。近年來(lái),抗腫瘤藥物的開發(fā)已從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性化療藥物過(guò)渡到分子靶向藥物。目前,酪氨酸激酶是僅次于G蛋白偶聯(lián)受體的第二大藥物靶點(diǎn)。已有研究報(bào)道多種小分子靶向的酪氨酸激酶抑制劑類藥物(Tyrosine Kinase Inhibitors, TKIs)可通過(guò)抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的外排功能,進(jìn)而增敏化療藥物的療效,但其作用機(jī)制尚不明確。此外,鮮見有關(guān)TKIs類藥物與ABCB1之間相互作用模式的研究報(bào)道。阿法替尼(Afatinib)是首個(gè)不可逆的多靶點(diǎn)的TKI。與靶蛋白的不可逆性結(jié)合可導(dǎo)致下游信號(hào)通路持續(xù)受到抑制,產(chǎn)生更強(qiáng)的作用效果。因此,阿法替尼在與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體相互作用時(shí),相較于可逆性的TKIs類藥物可能具有不同的特性。然而,目前關(guān)于阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的MDR的研究尚未見報(bào)道。綜上,本課題擬通過(guò)研究阿法替尼對(duì)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的卵巢癌化療MDR的影響及其作用機(jī)制,探究阿法替尼作為MDR逆轉(zhuǎn)劑的潛力,進(jìn)一步揭示TKIs類藥物調(diào)控ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的機(jī)制,比較非可逆性TKIs類藥物相較于可逆性TKIs類藥物在逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的MDR作用方面的差異及優(yōu)勢(shì)。方法采用MTT法考察阿法替尼對(duì)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性及其逆轉(zhuǎn)耐藥卵巢癌細(xì)胞MDR的作用；通過(guò)siRNA干擾技術(shù)敲低卵巢癌細(xì)胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平,驗(yàn)證阿法替尼逆轉(zhuǎn)MDR的作用與.ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的相關(guān)性；應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL實(shí)驗(yàn),分別在體外及體內(nèi)水平考察阿法替尼對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響：通過(guò)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)考察阿法替尼體內(nèi)水平逆轉(zhuǎn)卵巢癌MDR的作用；采用羅丹明123蓄積實(shí)驗(yàn)、藥物體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)、小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)及ATPase活性實(shí)驗(yàn)考察阿法替尼對(duì)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的影響及其機(jī)制;通過(guò)western blot、RT-PCR、免疫組化、組織免疫熒光、細(xì)胞免疫熒光等實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)阿法替尼對(duì)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響并探究其機(jī)制；利用藥效團(tuán)模型考察阿法替尼抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);通過(guò)同源建模及分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)探究阿法替尼與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體相互作用的結(jié)合模式；應(yīng)用基因測(cè)序技術(shù)考察阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的MDR的作用是否涉及特定基因位點(diǎn)的突變。結(jié)果1.阿法替尼體外水平逆轉(zhuǎn)ABCB1介導(dǎo)的卵巢癌化療MDR紫杉醇對(duì)敏感株A2780及耐藥株A2780T細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度值(IC50)分別為0.039±0.003μM及198.92±14.85μM；阿霉素對(duì)敏感株A2780及耐藥株A2780T細(xì)胞的IC50分別為1.17±0.06μM及27.69±2.11μM;紫杉醇對(duì)敏感株SKOV3及耐藥株SKOV3-DDP細(xì)胞的IC50分別為0.033±0.002μM及41.79± 3.67μM；阿霉素對(duì)敏感株SKOV3及耐藥株SKOV3-DDP細(xì)胞的IC50分別為0.97±0.07μtM及18.13±1.54μM。以上敏感株與耐藥株對(duì)化療藥物的敏感性差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),表明本實(shí)驗(yàn)中所采用的兩種耐藥株細(xì)胞相較于兩種敏感株細(xì)胞,對(duì)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體底物性化療藥物紫杉醇及阿霉素具有高度的耐藥性。卵巢癌耐藥株A2780T細(xì)胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白表達(dá)水平及MDR1基因mRNA水平分別是敏感株A2780細(xì)胞內(nèi)的83.3倍及142.9倍；卵巢癌耐藥株SKOV3-DDP細(xì)胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白表達(dá)水平及MDR1基因mRNA水平分別是敏感株SKOV3細(xì)胞內(nèi)的37.0倍及23.3倍。阿法替尼可濃度依賴性的顯著降低紫杉醇及阿霉素對(duì)ABCB1高表達(dá)的耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780T及SKOV3-DDP的IC50。聯(lián)用0.625μM、1.25μM及2.5μM的阿法替尼時(shí),紫杉醇對(duì)A2780T細(xì)胞的IC50分別為115.53±6.65μM、19.74±1.19μM及8.86±0.721μM,較未聯(lián)用阿法替尼組紫杉醇的IC50分別顯著下降了1.72倍、10.08倍及22.45倍(P0.01)；聯(lián)用0.375μM、0.75μM及1.5μM的阿法替尼時(shí),紫杉醇對(duì)SKOV3-DDP細(xì)胞的IC50分別為23.53±2.47μM、9.82± 0.80μM及5.75±0.471μM,較未聯(lián)用阿法替尼組紫杉醇的IC50分別顯著下降了1.78倍、4.26倍及7.27倍(P0.01)；聯(lián)用0.625μM、1.25μM及2.5μM的阿法替尼時(shí),阿霉素對(duì)A2780T細(xì)胞的IC50分別為6.24±0-37μM、3.93±0.22μM及1.57±0.13μM,較未聯(lián)用阿法替尼組阿霉素的IC50分別顯著下降了4.44倍、7.05倍及17.64倍(P0.01)；聯(lián)用0.375μM、0.75μM及1.5μM的阿法替尼時(shí),阿霉素對(duì)SKOV3-DDP細(xì)胞的IC50分別為9.17±1.05μM、3.58±0.29μM及1.25±0.13μM,較未聯(lián)用阿法替尼組阿霉素的IC50分別顯著下降了1.98倍、5.06倍及14.50倍(P0.01)。然而,阿法替尼不改變紫杉醇及阿霉素對(duì)ABCB1低表達(dá)的卵巢癌敏感株A2780及SKOV3細(xì)胞的IC50。此外,阿法替尼逆轉(zhuǎn)耐藥卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇及阿霉素MDR的效果,強(qiáng)于相同濃度的可逆性的TKIs類藥物拉帕替尼及經(jīng)典的ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑維拉帕米(10μM)。敲低A2780T及SKOV3-DDP細(xì)胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平,可顯著降低紫杉醇及阿霉素對(duì)A2780T及SKOV3-DDP細(xì)胞的IC50(P0.01)。聯(lián)用阿法替尼可進(jìn)一步顯著降低紫杉醇及阿霉素對(duì)A2780T/ABCB1-及SKOV3-DDP/ABCB1-的IC50(P0.01)。2.阿法替尼體內(nèi)水平逆轉(zhuǎn)ABCB1介導(dǎo)的MDR對(duì)照組、紫杉醇組、阿法替尼組及阿法替尼與紫杉醇聯(lián)用組腫瘤平均重量分別為0.707±0.229 g、0.655±0.289 g、0.247±0.088 g及0.113±0.079 g。阿法替尼與紫杉醇聯(lián)用不僅顯著延緩了荷瘤裸鼠背部A2780T細(xì)胞異種移植瘤的生長(zhǎng),抑制率為84.02%,而且顯著誘導(dǎo)了腫瘤壞死及腫瘤退行性生長(zhǎng)。3.阿法替尼體內(nèi)外水平均可顯著增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的耐藥卵巢癌細(xì)胞的凋亡作用阿法替尼體外水平可濃度依賴性的顯著增加紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌A2780T及SKOV3-DDP細(xì)胞的凋亡率(P0.01)。此外,體內(nèi)TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,阿法替尼與紫杉醇聯(lián)用組裸鼠腫瘤組織鏡下可見大量陽(yáng)性染色的細(xì)胞核,且核破裂及核溶解的細(xì)胞比例增加,表明該組腫瘤組織發(fā)生了顯著的細(xì)胞壞死。4.阿法替尼抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的外排功能,激活其ATPase活性聯(lián)用阿法替尼(0.625～10μM)可濃度依賴性的顯著增加羅丹明123在A2780T細(xì)胞內(nèi)的蓄積(P0.05),而對(duì)其在A2780細(xì)胞內(nèi)的蓄積沒有顯著影響(P0.05)。有意義的是,阿法替尼與羅丹明123聯(lián)用組荷瘤裸鼠腫瘤區(qū)域的熒光強(qiáng)度值較羅丹明123組顯著增加了2.28倍(P0.01)。阿法替尼(0.625～10μM)可濃度依賴性的顯著減少羅丹明123自A2780T細(xì)胞中的外排量(P0.05),而對(duì)其自A2780細(xì)胞內(nèi)的外排量沒有顯著影響(P0.05)。上述結(jié)果表明阿法替尼可通過(guò)抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的外排功能,進(jìn)而增加羅丹明123在A2780T細(xì)胞內(nèi)的蓄積。此外,阿法替尼及紫杉醇均可激活A(yù)BCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的ATPase活性。激活50%的ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的ATPase活性所需的紫杉醇及阿法替尼的濃度分別為70.1μM及2.5μM。5.阿法替尼通過(guò)抑制NF-κB通路的激活進(jìn)而下調(diào)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)阿法替尼可濃度依賴性的顯著抑制ABCB1高表達(dá)的卵巢癌A2780T及SKOV3-DDP細(xì)胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白表達(dá)水平及MDR1基因的mRNA水平,而可逆性的TKIs類藥物拉帕替尼不具有此作用。阿法替尼也可下調(diào)接種A2780T細(xì)胞獲得的荷瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白表達(dá)水平。此外,NF-κB抑制劑PDTC及NF-κB亞基p65特異性的siRNA均能下調(diào)A2780T細(xì)胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平。此外,阿法替尼可顯著降低A2780T細(xì)胞胞漿及胞核內(nèi)NF-κB亞基p65的表達(dá)水平,同時(shí)也可顯著抑制IκBα的磷酸化及降解。與NF-κB的抑制劑PDTC作用相似,阿法替尼可下調(diào)A2780T細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)的核p65水平及抑制LPS誘導(dǎo)的p65的核轉(zhuǎn)位。上述結(jié)果表明阿法替尼可通過(guò)抑制NF-κB通路的激活,進(jìn)而下調(diào)耐藥卵巢癌細(xì)胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。阿法替尼可顯著抑制A2780T細(xì)胞內(nèi)AKT的磷酸化,而對(duì)AKT總蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。此外,PI3K/AKT通路特異性抑制劑LY294002也可顯著抑制A2780T細(xì)胞內(nèi)p65的核轉(zhuǎn)位。阿法替尼與LY294002在抑制A2780T細(xì)胞內(nèi)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)方面具有協(xié)同作用。阿法替尼可能通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT通路,進(jìn)而抑制NF-κB通路的激活,起到下調(diào)BCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的作用。6.阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的卵巢癌MDR的作用與抑制MAPK/p38通路相關(guān)已有研究報(bào)道通過(guò)抑制EGFR下游的MAPK通路可部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。阿法替尼可濃度依賴性的抑制A2780T細(xì)胞內(nèi)EGFR、HER-2及p38的磷酸化,而對(duì)EGFR、HER-2及p38的總蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。此外,阿法替尼對(duì)A2780T細(xì)胞內(nèi)JNK及ERK1/2的總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平均沒有顯著影響。p38及AKT是NF-κB通路的上游調(diào)節(jié)蛋白,該結(jié)果表明阿法替尼可通過(guò)抑制EGFR及HER-2的磷酸化,進(jìn)而下調(diào)其下游的MAPK/p38及PI3K/AKT通路,抑制NF-κB通路的激活,起到下調(diào)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的作用。7.本研究中阿法瞀尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的卵巢癌MDR的作用不涉及EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變超過(guò)90%的EGFR突變發(fā)生在EGFR受體的酪氨酸激酶區(qū)域,該區(qū)域由EGFR基因的18-21號(hào)外顯子編碼。測(cè)序結(jié)果顯示,卵巢癌敏感株(A2780及SKOV3)及耐藥株(A2780T及SKOV3-DDP)細(xì)胞內(nèi)EGFR基因的18-21號(hào)外顯子均為野生型,未發(fā)生突變,表明本研究中阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的卵巢癌MDR的作用不涉及EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變。8.阿法替尼作為ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)選擇性的ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑應(yīng)具有5個(gè)藥效團(tuán)特征,包括1個(gè)芳香環(huán)、1個(gè)疏水中心和3個(gè)氫鍵受體。阿法替尼與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑的藥效團(tuán)模型匹配性極佳。阿法替尼分子結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)與藥效團(tuán)模型中的芳香環(huán)相對(duì)應(yīng)；阿法替尼分子結(jié)構(gòu)中的氟原子及其相連的苯環(huán)構(gòu)成了疏水中心,與藥效團(tuán)模型中的疏水中心相對(duì)應(yīng)；阿法替尼分子結(jié)構(gòu)中的3個(gè)氧原子與藥效團(tuán)模型中的3個(gè)氫鍵受體相對(duì)應(yīng)。因此,阿法替尼具有ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑的藥效團(tuán)特征。9.阿法替尼與ABCB1阜運(yùn)體之間的結(jié)合模式分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿法替尼與人ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體有2個(gè)結(jié)合域,包括1個(gè)底物結(jié)合域和1個(gè)ATP結(jié)合域。阿法替尼與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的ATP結(jié)合域及底物結(jié)合域的結(jié)合能分別是-14.05 kcal/mol及-14.09 kcal/mol。阿法替尼與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的ATP結(jié)合域的相互作用包括3個(gè)氫鍵和一個(gè)H-π作用。其中,阿法替尼分子結(jié)構(gòu)中的四氫呋喃環(huán)上的氧原子與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的Gly533及Gly534兩個(gè)位點(diǎn)形成2個(gè)氫鍵;分子結(jié)構(gòu)中的的叔胺基與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的Lys536位點(diǎn)形成1個(gè)氫鍵；分子結(jié)構(gòu)中的含N雜環(huán)與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體中的Ala560位點(diǎn)形成1個(gè)H-π作用。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),人正常L02細(xì)胞、未處理的卵巢癌敏感株、耐藥株細(xì)胞及阿法替尼給藥后的卵巢癌敏感株、耐藥株細(xì)胞在這4個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)生突變,表明本研究中阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的卵巢癌MDR的作用不涉及該4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的突變。結(jié)論阿法替尼體內(nèi)外水平均可顯著逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的卵巢癌化療的MDR。與可逆性的TKIs類藥物不同,首個(gè)不可逆性的TKIs類藥物阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的MDR的作用具有雙模式：即阿法替尼不僅可抑制ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的外排功能并激活其ATPase活性,還可通過(guò)下調(diào)MAPK/p38及PI3K/AKT通路,進(jìn)而抑制NF-κB通路的激活及MDR1基因的轉(zhuǎn)錄活性,下調(diào)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。此外,除作用于ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物結(jié)合域外,阿法替尼還可能與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的Gly533, Gly534, Lys536及Ala560四個(gè)位點(diǎn)形成氫鍵,進(jìn)而作用于ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體的ATP結(jié)合域。且本研究中阿法替尼逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的卵巢癌MDR的作用不涉及上述4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的突變及EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變。本研究提示可將阿法替尼與ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體底物性化療藥物(紫杉醇、阿霉素等)聯(lián)用,以取得更佳的化療效果并逆轉(zhuǎn)MDR。本研究有助于從分子靶向藥物中尋找高效的ABCB1抑制劑,以更加安全有效的逆轉(zhuǎn)ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的MDR。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2364664