【摘要】：自噬是真核細(xì)胞利用溶酶體降解大分子物質(zhì)的途徑,它通過(guò)形成雙層膜結(jié)構(gòu)包裹細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及其它大分子物質(zhì),再運(yùn)送到溶酶體中降解成氨基酸、脂肪酸和核苷等基本單元,從而維持細(xì)胞正常的能量循環(huán)。腫瘤是最早發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的疾病之一。然而,自噬在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用卻尚無(wú)定論。一方面,自噬可促進(jìn)腫瘤生存并維持其活性,幫助腫瘤細(xì)胞抵御低氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、DNA損傷和氧化應(yīng)激等不利環(huán)境；另一方面,自噬也可以作為腫瘤細(xì)胞死亡的途徑,并且在某些情況下還可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。 NF-κB是另一種在腫瘤的形成和增殖過(guò)程中起重要作用的核轉(zhuǎn)錄因子,它可以通過(guò)上調(diào)IAPs家族蛋白、Bcl-2家族蛋白、JNK、c-FLIP等與細(xì)胞存活、增殖相關(guān)的基因表達(dá)或誘導(dǎo)凋亡抑制基因過(guò)表達(dá)而發(fā)揮抗凋亡作用。許多腫瘤細(xì)胞中均存在NF-κB的持續(xù)高表達(dá)及IκBα的突變失活或降解異常,導(dǎo)致上調(diào)多藥耐藥基因的表達(dá)水平,使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性。因此,通過(guò)阻滯NF-κB活化已成為治療某些腫瘤的新策略。 青蒿素(Artemisinin)是我國(guó)研究者在二十世紀(jì)七十年代首次從菊科植物黃花蒿(Artemisia annua Linn)中提取的一種新型倍半萜內(nèi)酯。二氫青蒿素(Dihydroartemisinin, DHA)是青蒿素類藥物在體內(nèi)的主要活性代謝物。近年來(lái)的研究證實(shí),二氫青蒿素具有良好和廣譜的抗腫瘤活性。本課題組的前期研究也表明,二氫青蒿素對(duì)肺癌(Lewis)、人多發(fā)性骨髓瘤(RPMI8226)以及白血病(K562,HL60)細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的增殖均具有明顯的抑制效果。我們最近又發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素能顯著誘導(dǎo)多株腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)。關(guān)于二氫青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬的作用還未見(jiàn)報(bào)道,其具體機(jī)制更不甚清楚。本論文選取人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞株作為主要研究對(duì)象,重點(diǎn)考察NF-κB通路在二氫青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬中的作用機(jī)制。 結(jié)果： 1.DHA誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞發(fā)生自噬 RPMI8226細(xì)胞經(jīng)DHA (10μM,20μM,40μM)作用24h后,自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ型的表達(dá)明顯上調(diào),p62的表達(dá)下調(diào),并且LC3蛋白由對(duì)照組的彌散狀態(tài)變成明顯點(diǎn)狀聚集,且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。吖啶橙染色后,通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分別發(fā)現(xiàn),DHA (10μM,20μM,40μiM)作用24h后,RPMI8226細(xì)胞內(nèi)酸性自噬泡的數(shù)量明顯增加。細(xì)胞經(jīng)氯喹(5μM,30min)預(yù)處理后,發(fā)現(xiàn)氯喹可增強(qiáng)DHA(20μpM,24h)誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的表達(dá)水平。經(jīng)DHA (20μM,24h)作用后,通過(guò)透射電鏡也觀察到細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量明顯增加,而且其中包裹有類似線粒體樣內(nèi)容物。通過(guò)Mitotracker Red對(duì)線粒體染色,分析LC3蛋白與線粒體的共定位情況,發(fā)現(xiàn)DHA作用后兩者共定位情況明顯增加。 2.DHA通過(guò)抑制多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞中NF-κB的激活導(dǎo)致自噬反應(yīng)發(fā)生 2.1DHA抑制RPMI8226細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活性 RPMI8226細(xì)胞經(jīng)DHA (10μM,20μiM,40μM)作用12h后,在全細(xì)胞范圍內(nèi),IκBa蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào),磷酸化IκBα蛋白水平下調(diào),p65的表達(dá)卻基本保持不變；在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,DHA分別下調(diào)和上調(diào)p65蛋白的水平。通過(guò)免疫熒光對(duì)p65蛋白染色,發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞內(nèi)p65彌散分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；DHA作用后,p65主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。EMSA分析的結(jié)果也顯示,RPMI8226經(jīng)DHA(10μM,20μM,40μM)作用12h后,NF-κB結(jié)合反應(yīng)元件的能力逐漸下降。 2.2TNF-a逆轉(zhuǎn)DHA抑制RPMI8226細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性的作用 在全細(xì)胞范圍內(nèi),DHA (20μM)作用12h后分別造成iKBa蛋白累積的增加和磷酸化IKBa蛋白的減少；細(xì)胞經(jīng)TNF-a (20ng/ml,30min)預(yù)孵育后,IKBa蛋白和磷酸化IKBa蛋白的水平分別發(fā)生下調(diào)和上調(diào)。在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,DHA單用分別減少和增加p65蛋白的水平；細(xì)胞經(jīng)TNF-a預(yù)處理后,p65蛋白的水平分別發(fā)生上調(diào)和下調(diào)。EMSA分析也發(fā)現(xiàn),單用DHA (20μM,12h)可抑制RPMI8226細(xì)胞內(nèi)NF-κB結(jié)合反應(yīng)元件的能力；細(xì)胞經(jīng)TNF-a (20ng/ml,30min)預(yù)處理后,NF-κB結(jié)合反應(yīng)元件的能力得到增強(qiáng)。 2.3DHA抑制NF-κB活性與誘導(dǎo)自噬反應(yīng)的時(shí)效變化分析 時(shí)效分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn),RPMI8226細(xì)胞經(jīng)DHA (20μM)作用12h后,磷酸化κBa蛋白的表達(dá)開(kāi)始減少,同時(shí)IKBa蛋白累積增加；另一方面,自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)一直到24h才明顯上調(diào)。 2.4TNF-a逆轉(zhuǎn)DHA誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞發(fā)生的自噬反應(yīng) RPMI8226細(xì)胞經(jīng)DHA (20μM,24h)作用后,自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯增加,細(xì)胞經(jīng)TNF-a (20ng/mL,30min)預(yù)孵育后,DHA誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ累積明顯減少。另一方面,DHA (20μM,24h)處理可顯著增加RPMI8226細(xì)胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量；細(xì)胞經(jīng)TNF-a (20ng/mL,30min)預(yù)孵育后,DHA誘導(dǎo)生成的自噬泡數(shù)量明顯減少。 2.5過(guò)表達(dá)p65逆轉(zhuǎn)DHA誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的自噬反應(yīng) 通過(guò)慢病毒方法在RPMI8226細(xì)胞內(nèi)表達(dá)p65質(zhì)粒。Western Blot的結(jié)果顯示,與空白質(zhì)粒相比,經(jīng)慢病毒感染的RPMI8226細(xì)胞內(nèi)p65蛋白的表達(dá)顯著增加。正常RPMI8226細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)p65質(zhì)粒的RPMI8226細(xì)胞經(jīng)DHA(20μM,12h)作用后,通過(guò)核質(zhì)分離方法分別得到兩種細(xì)胞的核蛋白,再通過(guò)Western Blot方法檢測(cè)兩種細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白表達(dá)的變化。發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組細(xì)胞相比,DHA可分別下調(diào)兩種細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白的表達(dá),但是在表達(dá)p65質(zhì)粒的RPMI8226細(xì)胞的核內(nèi),p65的水平還是較正常細(xì)胞顯著上調(diào)。 再通過(guò)Western Blot方法檢測(cè)兩種細(xì)胞經(jīng)DHA作用后,自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)梯度濃度的DHA (10μM,20μM,40μM)作用后24h后,正常RPMI8226細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白出現(xiàn)累積；反之,在表達(dá)p65質(zhì)粒的RPMI8226細(xì)胞內(nèi),DHA作用后LC3-Ⅱ蛋白并未出現(xiàn)明顯變化。進(jìn)一步對(duì)藥物處理后的兩種細(xì)胞進(jìn)行AO染色,再通過(guò)流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)梯度濃度的DHA (10μM,20μM,40μM)作用24h后,正常RPMI8226細(xì)胞內(nèi),自噬泡數(shù)量明顯上調(diào)；相反,在表達(dá)p65質(zhì)粒的RPMI8226細(xì)胞內(nèi),自噬泡數(shù)量未出現(xiàn)顯著變化。 3.DHA抑制NF-κB活性導(dǎo)致自噬也發(fā)生在早幼粒白血病NB4細(xì)胞,結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞和官頸癌Hela細(xì)胞中 DHA作用于NB4細(xì)胞(10μM)、HCT116細(xì)胞(5μM)和Hela細(xì)胞(5μM)24h后,三株細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ均出現(xiàn)累積增加；反之,預(yù)孵育TNF-α(20ng/ml,30min)后,DHA誘導(dǎo)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)。進(jìn)一步對(duì)DHA處理后的三株細(xì)胞進(jìn)行AO染色,再通過(guò)流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DHA作用均可導(dǎo)致三株細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量的明顯增加；反之,預(yù)孵育TNF-a后,DHA誘導(dǎo)生成的自噬泡數(shù)量均出現(xiàn)下調(diào)。 4.DHA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬與活性氧(ROS)的過(guò)度產(chǎn)生有關(guān) 4.1DHA上調(diào)RPMI8226細(xì)胞內(nèi)ROS的水平 RPMI8226細(xì)胞經(jīng)DHA (10μM,20μM,40μM)作用15h后,采用DHE染色,再通過(guò)流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHA作用后,細(xì)胞內(nèi)ROS的水平明顯發(fā)生上調(diào)。 4.2DHA抑制RPMI8226細(xì)胞內(nèi)FHC和MnSOD的活性 Western Blot結(jié)果顯示,梯度濃度的DHA (10μM,20μM,40μM)作用15h可明顯下調(diào)RPMI8226細(xì)胞內(nèi)FHC和MnSOD蛋白的表達(dá)。再通過(guò)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總SOD的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)DHA (10μM,20μM,40μpM)處理后的PMI8226細(xì)胞內(nèi)總SOD的活性呈梯度下調(diào)。 4.3TNF-a逆轉(zhuǎn)DHA抑制RPMI8226細(xì)胞內(nèi)FHC和MnSOD活性的作用 DHA(20μM,15h)單用可分別下調(diào)細(xì)胞內(nèi)FHC和MnSOD蛋白的表達(dá)水平；反之,NF-a (20ng/ml,30min)預(yù)處理后,DHA對(duì)FHC和MnSOD蛋白表達(dá)的抑制作用均有一定程度的逆轉(zhuǎn)。 4.4TEMPO逆轉(zhuǎn)DHA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生的自噬反應(yīng) DHA (20μpM,24h)單用可分別導(dǎo)致兩株細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白的累積；相反,細(xì)胞經(jīng)TEMPO (2mM,30min)預(yù)處理后,DHA誘導(dǎo)LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯減少。進(jìn)一步通過(guò)AO對(duì)經(jīng)DHA和TEMPO處理后的RPMI8226細(xì)胞和NB4細(xì)胞進(jìn)行染色,再通過(guò)流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)兩株細(xì)胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DHA (20μpM,24h)單用可分別上調(diào)兩種細(xì)胞內(nèi)自噬泡的數(shù)量；反之,TEMPO (2mM,30min)預(yù)處理后,兩株細(xì)胞內(nèi)DHA誘導(dǎo)生成的自噬泡數(shù)量明顯減少。 5.DHA誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞發(fā)生凋亡與NF-kB活性被抑制有關(guān) PI單染的結(jié)果顯示,RPMI8226細(xì)胞經(jīng)DHA (20μM)作用24小時(shí)后,凋亡率明顯增加。細(xì)胞預(yù)孵育TNF-a (20ng/mL,30min)后,再用DHA處理,凋亡率顯著減少。 上述研究結(jié)果表明,①DHA誘導(dǎo)自噬反應(yīng)主要是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性引起的；②抑制NF-κB活性的作用是通過(guò)抑制IκBα蛋白的磷酸化降解,導(dǎo)致IκBα蛋白累積,從而阻滯p65的核轉(zhuǎn)位而實(shí)現(xiàn)的；③抑制NF-κB活性造成下游調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS水平的關(guān)鍵酶類FHC和MnSOD的表達(dá)減少,從而上調(diào)ROS水平,并進(jìn)一步引發(fā)自噬反應(yīng)。 結(jié)論： 二氫青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬主要是通過(guò)抑制NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的,此過(guò)程與ROS的過(guò)度產(chǎn)生有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2352041