【摘要】：癌癥致死率高,嚴重威脅著人類的生命健康。導致癌癥高致死率的重要原因之一是其的高侵襲和高轉移特性。以肝癌為例,手術切除及術后輔助治療雖一定程度上可延長患者生存期,但由于肝癌的高侵襲和轉移特點,其預后較差,復發(fā)率高。腫瘤的侵襲轉移是一個多步驟的復雜進程,主要過程包括:①腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離;②腫瘤細胞遷移到血管或淋巴管;③腫瘤細胞穿透血管腔;④逃脫免疫系統(tǒng);⑤在遠處與血管內(nèi)皮粘附;⑥從血管中溢出到新的組織;⑦在新宿主組織中腫瘤細胞存活并生長。其中,細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)和細胞基底膜(Basement memBrane,BM)的降解涉及到侵襲和轉移的多個階段,是其中的重要步驟之一。正常情況下,ECM和BM是機體中高度有序的屏障結構,主要成分為Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等,其中Ⅳ型膠原為最主要成分。在腫瘤侵襲和轉移過程中,腫瘤細胞通過釋放多種蛋白水解酶,如基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)和乙酰肝素酶(Heparinase,HPA),降解ECM和BM,促進癌細胞在體內(nèi)的侵襲和轉移。其中,MMPs可降解多種膠原蛋白,在ECM和BM降解過程中發(fā)揮著重要作用,近年來已成為抗腫瘤侵襲和轉移的熱門靶點之一。基質金屬蛋白酶MMPs是一類依賴于Zn2+,Ca2+的內(nèi)肽酶,目前已發(fā)現(xiàn)20余種,其在胚胎發(fā)育、免疫、血管生成、炎癥、腫瘤侵襲及轉移過程中均發(fā)揮著重要作用。MMPs家族結構具有同源性,均由三個保守序列組成,分別為N端前肽區(qū)、催化區(qū)和C端血紅素結合蛋白樣結構域。正常情況下,MMPs在體內(nèi)表達水平較低,但研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤發(fā)展進程中,MMPs表達會異常升高,通過降解ECM和BM,促進腫瘤的侵襲和轉移過程。MMPs在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。MMPs,尤其是MMP-2、-9,可降解ECM和BM中的多種膠原,使原本隱藏在基底膜的相關位點暴露出來,促進腫瘤細胞的轉移。同時,MMPs通過降解ECM,釋放貯存在ECM中的多種生長因子促進腫瘤發(fā)展。此外,MMPs還可增強腫瘤細胞與宿主細胞間的粘附作用,促進腫瘤新生血管生成等。總之,MMPs在腫瘤的生長、轉移及腫瘤組織的血管生成過程中都起到了十分關鍵的作用。因此MMPs,特別是MMP-2、-9成為近來抗腫瘤侵襲和轉移的重要靶點之一。MMPs在正常組織中表達水平較低,其表達與調(diào)控主要包括基因表達調(diào)控、酶原活化過程的調(diào)控和MMPs天然抑制物的調(diào)節(jié)三個方面。MMPs基因的啟動子內(nèi)含多種轉錄因子結合位點,如核轉錄因子NF-κβ、激活蛋白-1(AP-1)位點、信號轉導和轉錄激活因子(STAT)、Ets transcription factors PEA3等,多種因素均可誘導或抑制其轉錄因子表達及活化,從而啟動或抑制MMPs表達。MMPs以酶原形式分泌,只有被激活后才具有降解BM和ECM的活性,人體內(nèi)存在天然的MMPs特異抑制劑,稱之為組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinas,TIMPs),包括 TIMP-1、-2、-3、-4。TIMPs 可通過非共價鍵形式與MMPs催化區(qū)的Zn2+活性中心結合,抑制MMPs的活性。因此,體內(nèi)MMP/TIMP之間的相互平衡也影響著MMPs活性。多種生長因子可調(diào)控MMPs的表達水平,其中TGF-β介導的信號通路對MMPs表達水平的調(diào)控發(fā)揮這重要作用,越來越引起人們的重視。TGF-β可激活經(jīng)典的Smad信號通路和非Smad信號傳導通路,如促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路,包括ERK1/2,JNK和p38,PI3K(磷酸肌醇激酶)/AKT1,2信號通路;NF-κβ信號通路等。其中多項研究證明,TGF-β可通過MAPK及NF-κβ信號通路調(diào)控多種MMPs的表達水平,在腫瘤侵襲和轉移過程中發(fā)揮著重要作用。因此,通過抑制TGF-β介導的信號通路進而抑制MMPs表達水平成為抗腫瘤侵襲和轉移的熱點之一。目前,MMPs的抑制劑主要包括5類,分別是天然抑制劑(如TIMPs、endostatin 及 angiostatin)、肽類 MMPs 抑制劑(如 Batimastat、Marimastat 和Salimastat)、非肽類 MMPs 抑制劑(AG3340、BAY12-9566、CGS27023A)、四環(huán)素類MMPs抑制劑(COL-3、多西環(huán)素)、雙膦酸鹽類MMPs抑制劑。此外,多糖類抗腫瘤藥物也表現(xiàn)出抗腫瘤侵襲和轉移活性,其中,肝素作為聚陰離子糖胺聚糖,臨床上主要應用于抗凝,但近來研究發(fā)現(xiàn),肝素表現(xiàn)出多種抗腫瘤活性,且其抗腫瘤活性與抑制腫瘤侵襲和轉移過程中的蛋白水解酶如MMPs、HPA密切相關。為降低肝素的抗凝作用,提高其抗腫瘤活性,人們通過化學修飾手段,制備得到了一系列具有抗腫瘤活性的肝素衍生物。其中,具有代表性的有M402。研究發(fā)現(xiàn),M402可作用于腫瘤發(fā)展過程中的多個靶點,表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。此外,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),通過將肝素直接進行高碘酸鈉氧化和硼氫化鈉還原后得到的肝素乙二醇斷裂衍生物(HP-sp)亦表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性,并初步研究表明其抗腫瘤侵襲和轉移活性與抑制HPA的活性相關。但發(fā)現(xiàn)其HPA的抑制活性與抗侵襲活性并不一致,考慮到ECM和BM的降解還與MMPs相關,TGF-β介導的MAPK信號通路(包括p38、Erk信號通路)、NF-κ β信號通路對MMPs的表達有重要調(diào)控作用,因此,本課題以HP、M402作為對照,通過考察它們對高侵襲和高轉移性HepG2細胞及大鼠原發(fā)性肝癌模型的作用,進一步研究肝素及衍生物的抗腫瘤侵襲和轉移活性,并探討其抗腫瘤活性與MMPs活性、表達水平及TGF-β介導的信號通路的關系。本研究取得的主要成果有以下幾方面:1.肝素衍生物的制備通過對肝素及達肝素進行高碘酸鈉氧化和硼氫化鈉還原,得到HP-sp和M402,并應用高效分子排阻色譜法對其分子量進行分子量測定,測得HP分子量為 Mn=14037,Mw=17153,Mz=20697,HP-sp 分子量為 Mn=10697,Mw=13254,Mz=17261。該結果結合反應機制表明制備過程中甚少發(fā)生糖苷鍵斷裂,主要為開環(huán)反應。2.肝素及衍生物的體外抗腫瘤侵襲和轉移作用研究2.1利用MTT法測定肝素及其衍生物對腫瘤細胞HepG2增殖的影響采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測了肝素及衍生物對HepG2細胞增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn),采用低、中、高濃度的肝素及衍生物分別作用12h、24h、48h,肝素及衍生物對腫瘤細胞的增殖未表現(xiàn)出明顯的抑制作用。其中,在高濃度(500μg/mL)給藥處理后,HP抑制率為9.96%,HP-sp抑制率為25.9%,M402抑制率為31.2%,均無明顯的細胞毒性,提示肝素及衍生物的抗腫瘤活性與抑制細胞增殖活性無關,將來若成藥,在腫瘤治療過程中與其他細胞毒性藥物的聯(lián)合應用或可提高其抗腫瘤作用。2.2利用劃痕法測定了肝素及衍生物對HepG2細胞遷移能力的影響采用經(jīng)典的劃痕法測定了肝素及衍生物對HepG2細胞遷移能力的影響。研究發(fā)現(xiàn),HP、HP-sp、M402對HepG2細胞遷移能力均有明顯的抑制作用,且隨著藥物濃度的增高,給藥處理時間的增長,其抑制作用也明顯增強。其中,給藥24h 后,中濃度(200μg/mL)的 HP、HP-sp,高濃度(500μg/mL)的 HP、HP-sp、M402與陰性對照組相比均可抑制HepG2細胞的遷移(P0.05);當給藥36h后,中濃度及高濃度的HP、HP-sp、M402與陰性對照組相比均顯著抑制HepG2細胞的遷移(P0.05)。2.3利用Transwell小室法測定了肝素及衍生物對HepG2細胞遷移能力的影響采用Transwell小室法測定了肝素及衍生物對HepG2細胞遷移能力的影響。結果表明,給藥24h后,與空白對照自相比,低、中、高作用濃度(100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)的HP、HP-sp、M402組穿過小室的細胞數(shù)目均顯著減少,且呈現(xiàn)劑量依賴性,并表現(xiàn)出統(tǒng)計意義上的顯著性差異(P0.05)。2.4利用Matrigel法測定了肝素及衍生物對HepG2細胞侵襲能力的影響采用Matrigel膠,模擬ECM和BM環(huán)境,測定了肝素及衍生物對HepG2細胞侵襲能力的影響。結果表明,MMP抑制劑(MMPI)組、HP組、HP-sp組、M402組穿過Matrigel膠及Transwell小室上層的細胞數(shù)目明顯減少,且與空白對照組相比,HP-sp組穿過細胞數(shù)明顯下降(P0.05);HP、HP-sp、M402抑制HepG2穿過小室的能力強于MMPI組(P0.05)。2.5利用Wester Blot法測定了肝素及衍生物對TGF-β介導的信號通路中相關蛋白表達的作用通過Western Blot法測定了不同作用濃度(0、1、5、10、20μg/ml)的TGF-β對HepG2細胞中MMP-2、-9表達的影響。結果表明,TGF-β對HepG2細胞的MMP-2、-9分泌水平均有提高作用,且呈現(xiàn)劑量依賴性;其中,當作用濃度為10μg/ml時,TGF-β對MMP-2、-9表達水平均顯著提高。通過Western Blot法測定了HP、HP-5P、M402對TGF-β誘導的MMP-2、-9高表達的影響。用1Oμg/ml的TGF-β刺激后給予MMPI、HP、HP-sp、M402,結果表明,與TGF-β刺激組相比,HP、HP-sp、M402均可抑制MMP-2、-9表達水平。其中,MMPI、HP、HP-sp、M402組MMP-2的的相對含量分別降低為89.8%、65.5%、66.9%、61.8%,與 TGF-β刺激組相比,MMPI 組 MMP-2 蛋白含量略有下降,但未表現(xiàn)出顯著差異(P0.05),HP、HP-sp、M402組MMP-2蛋白含量均顯著下降(P0.05);MMP-9的相對含量分別降低為94.6%、61.9%、69.0%、69.5%,與TGF-β刺激組相比,MMPI組MMP-9含量略有下降,但未表現(xiàn)出顯著差異(P0.05),HP-sp、M402組MMP-9蛋白含量均明顯(P0.05)。通過Western Blot法測定了HP、HP-sp、M402對TGF-β介導的信號通路蛋白NF-κβ、p38、Erk表達的影響。結果表明,HP、HP-sp、M402均可抑制信號通路蛋白的表達,但MMPI的作用不明顯。與TGF-β刺激組相比,MMPI、HP、HP-sp、M402 組 NF-κβ 的相對含量分別降低為 87.6%、69.4%、59.8%、54.2%。與TGF-β刺激組相比,HP-sp組NF-κβ蛋白表達水平明顯下降(P0.05);p38的相對含量分別降低為82.3%、49.2%、67.5%、55.8%,與TGF-β刺激組相比,HP、HP-sp、M402組p38蛋白表達水平均明顯下降(P0.05);Erk的相對含量分別降低為92.8%、77.7%、59.6%、55.9%,雖也表現(xiàn)出抑制作用,但與TGF-β刺激組相比均未表現(xiàn)出顯著性差異。3.肝素及衍生物的體內(nèi)抗腫瘤侵襲和轉移作用研究通過建立高轉移及高侵襲性的大鼠肝癌模型,考察了 HP、HP-sp、M402在體內(nèi)的抗腫瘤侵襲和轉移活性及作用機制。與造模組相比,HP、HP-sp、M402在20mg/kg劑量下均能降低肝重/體重比值(肝重/體重比值是原發(fā)性腫瘤質量指數(shù)的指標之一,比值越大,腫瘤組織的數(shù)量及體積越大。),減少小鼠肝部結節(jié)數(shù),減輕由原發(fā)性肝癌轉移引起的肺部病變情況。大鼠肝臟HE染色結果表明,與造模組相比,HP、HP-sp、M402能有效抑制肝臟細胞壞死,減少肝竇淤血現(xiàn)象,減少細胞及纖維組織增生,改善肝臟病變狀況。大鼠肝臟免疫組化染色結果表明,造模組MMP-2、-9,特別是MMP-9表達水平明顯升高,且大量集中在血管周圍;與造模組相比,HP組、HP-sp組及M402組MMP-2、-9表達量明顯降低,證明肝素及衍生物均可抑制腫瘤的侵襲轉移過程,且與其降低MMP-2、-9表達水平密切相關。4.課題總結與創(chuàng)新本課題從細胞水平及動物水平上研究了 HP、HP-sp、M402的抗腫瘤侵襲和轉移活性及與MMPs表達水平的關系。結果表明,(1)HP、HP-sp、M402無明顯的細胞增殖抑制作用;(2)HP、HP-sp、M402能顯著抑制HepG2細胞遷移能力,且呈現(xiàn)時間和劑量依賴性;(3)HP、HP-sp、M402能顯著抑制HepG2細胞的侵襲,比MMPI抑制作用更強;(4)HP、HP-sp、M402均可明顯降低HepG2細胞的MMP-2、-9的表達水平;(5)HP、HP-sp、M402可顯著降低TGF-β/MAPK/p38/MMPs信號通路中p38蛋白表達水平;HP-sp可顯著降低TGF-β/NF-κβ/MMPs信號中NF-κβ蛋白表達水平。(6)HP、HP-sp、M402均可減少原發(fā)性肝癌大鼠模型中肝部腫瘤結節(jié)數(shù)和肺轉移;HP、HP-sp、M402均可顯著降低原發(fā)性肝癌大鼠肝部MMP-2,MMP-9表達水平。總之,在本實驗研究中,以HP和M402為對照,選取高侵襲和高轉移性細胞株HepG2細胞和高侵襲高轉移的原發(fā)性肝癌大鼠模型,研究了非抗凝活性的肝素衍生物HP-sp抗腫瘤活性與MMPs活性和表達水平關系及作用機制,結果表明HP-sp無細胞毒作用,可以通過抑制MMP-2和MMP-9的表達發(fā)揮體內(nèi)外抗腫瘤侵襲和轉移作用,該作用與抑制TGF-β介導的P38/NF-κβ信號通路有關。該研究豐富了 HP-sp抗腫瘤轉移的機制,即它是HPA和MMPs的雙重抑制劑,值得進一步研究。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 周晉;陳奕;丁健;;基底膜和腫瘤轉移[J];生理科學進展;2006年04期

2 劉燕,林瑞超,李波;云芝多糖抗腫瘤作用研究進展[J];中成藥;2001年10期

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本文編號：2350686