【摘要】：癌癥致死率高,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康。導(dǎo)致癌癥高致死率的重要原因之一是其的高侵襲和高轉(zhuǎn)移特性。以肝癌為例,手術(shù)切除及術(shù)后輔助治療雖一定程度上可延長(zhǎng)患者生存期,但由于肝癌的高侵襲和轉(zhuǎn)移特點(diǎn),其預(yù)后較差,復(fù)發(fā)率高。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜進(jìn)程,主要過(guò)程包括:①腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離;②腫瘤細(xì)胞遷移到血管或淋巴管;③腫瘤細(xì)胞穿透血管腔;④逃脫免疫系統(tǒng);⑤在遠(yuǎn)處與血管內(nèi)皮粘附;⑥從血管中溢出到新的組織;⑦在新宿主組織中腫瘤細(xì)胞存活并生長(zhǎng)。其中,細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)和細(xì)胞基底膜(Basement memBrane,BM)的降解涉及到侵襲和轉(zhuǎn)移的多個(gè)階段,是其中的重要步驟之一。正常情況下,ECM和BM是機(jī)體中高度有序的屏障結(jié)構(gòu),主要成分為Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等,其中Ⅳ型膠原為最主要成分。在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中,腫瘤細(xì)胞通過(guò)釋放多種蛋白水解酶,如基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)和乙酰肝素酶(Heparinase,HPA),降解ECM和BM,促進(jìn)癌細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移。其中,MMPs可降解多種膠原蛋白,在ECM和BM降解過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,近年來(lái)已成為抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的熱門(mén)靶點(diǎn)之一。基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs是一類(lèi)依賴(lài)于Zn2+,Ca2+的內(nèi)肽酶,目前已發(fā)現(xiàn)20余種,其在胚胎發(fā)育、免疫、血管生成、炎癥、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。MMPs家族結(jié)構(gòu)具有同源性,均由三個(gè)保守序列組成,分別為N端前肽區(qū)、催化區(qū)和C端血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域。正常情況下,MMPs在體內(nèi)表達(dá)水平較低,但研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤發(fā)展進(jìn)程中,MMPs表達(dá)會(huì)異常升高,通過(guò)降解ECM和BM,促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。MMPs在腫瘤發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。MMPs,尤其是MMP-2、-9,可降解ECM和BM中的多種膠原,使原本隱藏在基底膜的相關(guān)位點(diǎn)暴露出來(lái),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。同時(shí),MMPs通過(guò)降解ECM,釋放貯存在ECM中的多種生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤發(fā)展。此外,MMPs還可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞間的粘附作用,促進(jìn)腫瘤新生血管生成等�？傊�,MMPs在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及腫瘤組織的血管生成過(guò)程中都起到了十分關(guān)鍵的作用。因此MMPs,特別是MMP-2、-9成為近來(lái)抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)之一。MMPs在正常組織中表達(dá)水平較低,其表達(dá)與調(diào)控主要包括基因表達(dá)調(diào)控、酶原活化過(guò)程的調(diào)控和MMPs天然抑制物的調(diào)節(jié)三個(gè)方面。MMPs基因的啟動(dòng)子內(nèi)含多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),如核轉(zhuǎn)錄因子NF-κβ、激活蛋白-1(AP-1)位點(diǎn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)、Ets transcription factors PEA3等,多種因素均可誘導(dǎo)或抑制其轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化,從而啟動(dòng)或抑制MMPs表達(dá)。MMPs以酶原形式分泌,只有被激活后才具有降解BM和ECM的活性,人體內(nèi)存在天然的MMPs特異抑制劑,稱(chēng)之為組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinas,TIMPs),包括 TIMP-1、-2、-3、-4。TIMPs 可通過(guò)非共價(jià)鍵形式與MMPs催化區(qū)的Zn2+活性中心結(jié)合,抑制MMPs的活性。因此,體內(nèi)MMP/TIMP之間的相互平衡也影響著MMPs活性。多種生長(zhǎng)因子可調(diào)控MMPs的表達(dá)水平,其中TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)MMPs表達(dá)水平的調(diào)控發(fā)揮這重要作用,越來(lái)越引起人們的重視。TGF-β可激活經(jīng)典的Smad信號(hào)通路和非Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路,如促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路,包括ERK1/2,JNK和p38,PI3K(磷酸肌醇激酶)/AKT1,2信號(hào)通路;NF-κβ信號(hào)通路等。其中多項(xiàng)研究證明,TGF-β可通過(guò)MAPK及NF-κβ信號(hào)通路調(diào)控多種MMPs的表達(dá)水平,在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此,通過(guò)抑制TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)而抑制MMPs表達(dá)水平成為抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)之一。目前,MMPs的抑制劑主要包括5類(lèi),分別是天然抑制劑(如TIMPs、endostatin 及 angiostatin)、肽類(lèi) MMPs 抑制劑(如 Batimastat、Marimastat 和Salimastat)、非肽類(lèi) MMPs 抑制劑(AG3340、BAY12-9566、CGS27023A)、四環(huán)素類(lèi)MMPs抑制劑(COL-3、多西環(huán)素)、雙膦酸鹽類(lèi)MMPs抑制劑。此外,多糖類(lèi)抗腫瘤藥物也表現(xiàn)出抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性,其中,肝素作為聚陰離子糖胺聚糖,臨床上主要應(yīng)用于抗凝,但近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),肝素表現(xiàn)出多種抗腫瘤活性,且其抗腫瘤活性與抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的蛋白水解酶如MMPs、HPA密切相關(guān)。為降低肝素的抗凝作用,提高其抗腫瘤活性,人們通過(guò)化學(xué)修飾手段,制備得到了一系列具有抗腫瘤活性的肝素衍生物。其中,具有代表性的有M402。研究發(fā)現(xiàn),M402可作用于腫瘤發(fā)展過(guò)程中的多個(gè)靶點(diǎn),表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。此外,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)將肝素直接進(jìn)行高碘酸鈉氧化和硼氫化鈉還原后得到的肝素乙二醇斷裂衍生物(HP-sp)亦表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性,并初步研究表明其抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性與抑制HPA的活性相關(guān)。但發(fā)現(xiàn)其HPA的抑制活性與抗侵襲活性并不一致,考慮到ECM和BM的降解還與MMPs相關(guān),TGF-β介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路(包括p38、Erk信號(hào)通路)、NF-κ β信號(hào)通路對(duì)MMPs的表達(dá)有重要調(diào)控作用,因此,本課題以HP、M402作為對(duì)照,通過(guò)考察它們對(duì)高侵襲和高轉(zhuǎn)移性HepG2細(xì)胞及大鼠原發(fā)性肝癌模型的作用,進(jìn)一步研究肝素及衍生物的抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性,并探討其抗腫瘤活性與MMPs活性、表達(dá)水平及TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路的關(guān)系。本研究取得的主要成果有以下幾方面:1.肝素衍生物的制備通過(guò)對(duì)肝素及達(dá)肝素進(jìn)行高碘酸鈉氧化和硼氫化鈉還原,得到HP-sp和M402,并應(yīng)用高效分子排阻色譜法對(duì)其分子量進(jìn)行分子量測(cè)定,測(cè)得HP分子量為 Mn=14037,Mw=17153,Mz=20697,HP-sp 分子量為 Mn=10697,Mw=13254,Mz=17261。該結(jié)果結(jié)合反應(yīng)機(jī)制表明制備過(guò)程中甚少發(fā)生糖苷鍵斷裂,主要為開(kāi)環(huán)反應(yīng)。2.肝素及衍生物的體外抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移作用研究2.1利用MTT法測(cè)定肝素及其衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG2增殖的影響采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)了肝素及衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn),采用低、中、高濃度的肝素及衍生物分別作用12h、24h、48h,肝素及衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖未表現(xiàn)出明顯的抑制作用。其中,在高濃度(500μg/mL)給藥處理后,HP抑制率為9.96%,HP-sp抑制率為25.9%,M402抑制率為31.2%,均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性,提示肝素及衍生物的抗腫瘤活性與抑制細(xì)胞增殖活性無(wú)關(guān),將來(lái)若成藥,在腫瘤治療過(guò)程中與其他細(xì)胞毒性藥物的聯(lián)合應(yīng)用或可提高其抗腫瘤作用。2.2利用劃痕法測(cè)定了肝素及衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響采用經(jīng)典的劃痕法測(cè)定了肝素及衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響。研究發(fā)現(xiàn),HP、HP-sp、M402對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力均有明顯的抑制作用,且隨著藥物濃度的增高,給藥處理時(shí)間的增長(zhǎng),其抑制作用也明顯增強(qiáng)。其中,給藥24h 后,中濃度(200μg/mL)的 HP、HP-sp,高濃度(500μg/mL)的 HP、HP-sp、M402與陰性對(duì)照組相比均可抑制HepG2細(xì)胞的遷移(P0.05);當(dāng)給藥36h后,中濃度及高濃度的HP、HP-sp、M402與陰性對(duì)照組相比均顯著抑制HepG2細(xì)胞的遷移(P0.05)。2.3利用Transwell小室法測(cè)定了肝素及衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響采用Transwell小室法測(cè)定了肝素及衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果表明,給藥24h后,與空白對(duì)照自相比,低、中、高作用濃度(100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)的HP、HP-sp、M402組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目均顯著減少,且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性,并表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性差異(P0.05)。2.4利用Matrigel法測(cè)定了肝素及衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響采用Matrigel膠,模擬ECM和BM環(huán)境,測(cè)定了肝素及衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果表明,MMP抑制劑(MMPI)組、HP組、HP-sp組、M402組穿過(guò)Matrigel膠及Transwell小室上層的細(xì)胞數(shù)目明顯減少,且與空白對(duì)照組相比,HP-sp組穿過(guò)細(xì)胞數(shù)明顯下降(P0.05);HP、HP-sp、M402抑制HepG2穿過(guò)小室的能力強(qiáng)于MMPI組(P0.05)。2.5利用Wester Blot法測(cè)定了肝素及衍生物對(duì)TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的作用通過(guò)Western Blot法測(cè)定了不同作用濃度(0、1、5、10、20μg/ml)的TGF-β對(duì)HepG2細(xì)胞中MMP-2、-9表達(dá)的影響。結(jié)果表明,TGF-β對(duì)HepG2細(xì)胞的MMP-2、-9分泌水平均有提高作用,且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性;其中,當(dāng)作用濃度為10μg/ml時(shí),TGF-β對(duì)MMP-2、-9表達(dá)水平均顯著提高。通過(guò)Western Blot法測(cè)定了HP、HP-5P、M402對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的MMP-2、-9高表達(dá)的影響。用1Oμg/ml的TGF-β刺激后給予MMPI、HP、HP-sp、M402,結(jié)果表明,與TGF-β刺激組相比,HP、HP-sp、M402均可抑制MMP-2、-9表達(dá)水平。其中,MMPI、HP、HP-sp、M402組MMP-2的的相對(duì)含量分別降低為89.8%、65.5%、66.9%、61.8%,與 TGF-β刺激組相比,MMPI 組 MMP-2 蛋白含量略有下降,但未表現(xiàn)出顯著差異(P0.05),HP、HP-sp、M402組MMP-2蛋白含量均顯著下降(P0.05);MMP-9的相對(duì)含量分別降低為94.6%、61.9%、69.0%、69.5%,與TGF-β刺激組相比,MMPI組MMP-9含量略有下降,但未表現(xiàn)出顯著差異(P0.05),HP-sp、M402組MMP-9蛋白含量均明顯(P0.05)。通過(guò)Western Blot法測(cè)定了HP、HP-sp、M402對(duì)TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路蛋白NF-κβ、p38、Erk表達(dá)的影響。結(jié)果表明,HP、HP-sp、M402均可抑制信號(hào)通路蛋白的表達(dá),但MMPI的作用不明顯。與TGF-β刺激組相比,MMPI、HP、HP-sp、M402 組 NF-κβ 的相對(duì)含量分別降低為 87.6%、69.4%、59.8%、54.2%。與TGF-β刺激組相比,HP-sp組NF-κβ蛋白表達(dá)水平明顯下降(P0.05);p38的相對(duì)含量分別降低為82.3%、49.2%、67.5%、55.8%,與TGF-β刺激組相比,HP、HP-sp、M402組p38蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P0.05);Erk的相對(duì)含量分別降低為92.8%、77.7%、59.6%、55.9%,雖也表現(xiàn)出抑制作用,但與TGF-β刺激組相比均未表現(xiàn)出顯著性差異。3.肝素及衍生物的體內(nèi)抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移作用研究通過(guò)建立高轉(zhuǎn)移及高侵襲性的大鼠肝癌模型,考察了 HP、HP-sp、M402在體內(nèi)的抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性及作用機(jī)制。與造模組相比,HP、HP-sp、M402在20mg/kg劑量下均能降低肝重/體重比值(肝重/體重比值是原發(fā)性腫瘤質(zhì)量指數(shù)的指標(biāo)之一,比值越大,腫瘤組織的數(shù)量及體積越大。),減少小鼠肝部結(jié)節(jié)數(shù),減輕由原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)移引起的肺部病變情況。大鼠肝臟HE染色結(jié)果表明,與造模組相比,HP、HP-sp、M402能有效抑制肝臟細(xì)胞壞死,減少肝竇淤血現(xiàn)象,減少細(xì)胞及纖維組織增生,改善肝臟病變狀況。大鼠肝臟免疫組化染色結(jié)果表明,造模組MMP-2、-9,特別是MMP-9表達(dá)水平明顯升高,且大量集中在血管周?chē)?與造模組相比,HP組、HP-sp組及M402組MMP-2、-9表達(dá)量明顯降低,證明肝素及衍生物均可抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程,且與其降低MMP-2、-9表達(dá)水平密切相關(guān)。4.課題總結(jié)與創(chuàng)新本課題從細(xì)胞水平及動(dòng)物水平上研究了 HP、HP-sp、M402的抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移活性及與MMPs表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果表明,(1)HP、HP-sp、M402無(wú)明顯的細(xì)胞增殖抑制作用;(2)HP、HP-sp、M402能顯著抑制HepG2細(xì)胞遷移能力,且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)性;(3)HP、HP-sp、M402能顯著抑制HepG2細(xì)胞的侵襲,比MMPI抑制作用更強(qiáng);(4)HP、HP-sp、M402均可明顯降低HepG2細(xì)胞的MMP-2、-9的表達(dá)水平;(5)HP、HP-sp、M402可顯著降低TGF-β/MAPK/p38/MMPs信號(hào)通路中p38蛋白表達(dá)水平;HP-sp可顯著降低TGF-β/NF-κβ/MMPs信號(hào)中NF-κβ蛋白表達(dá)水平。(6)HP、HP-sp、M402均可減少原發(fā)性肝癌大鼠模型中肝部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和肺轉(zhuǎn)移;HP、HP-sp、M402均可顯著降低原發(fā)性肝癌大鼠肝部MMP-2,MMP-9表達(dá)水平。總之,在本實(shí)驗(yàn)研究中,以HP和M402為對(duì)照,選取高侵襲和高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株HepG2細(xì)胞和高侵襲高轉(zhuǎn)移的原發(fā)性肝癌大鼠模型,研究了非抗凝活性的肝素衍生物HP-sp抗腫瘤活性與MMPs活性和表達(dá)水平關(guān)系及作用機(jī)制,結(jié)果表明HP-sp無(wú)細(xì)胞毒作用,可以通過(guò)抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)發(fā)揮體內(nèi)外抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移作用,該作用與抑制TGF-β介導(dǎo)的P38/NF-κβ信號(hào)通路有關(guān)。該研究豐富了 HP-sp抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制,即它是HPA和MMPs的雙重抑制劑,值得進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號(hào)：2350686