【摘要】：T型鈣通道(又名低電壓激活鈣通道,LVA)家族由三種亞型所組成:CACNA1G編碼的Cav3.1,CACNA1H編碼的Cav3.2,CACNA1I編碼的Cav3.3。這些通道因其低電壓激活特性使得其可在神經(jīng)元靜息膜電位附近被部分激活,并具有快激活、快失活、慢去活特性。越來越多的研究報道T型鈣通道在外周痛覺通路中有重要的作用。在外周軀體感覺系統(tǒng),T型鈣通道主要表達于小的、TRPV1敏感的傷害性感覺神經(jīng)元和低閾值機械感受器(LTMRs),包括Aδ-LTMRs和C-LTMRs。這些感受器分布于皮膚毛囊。已有研究報道,外周感覺神經(jīng)元中表達的T型鈣通道亞型主要是Cav3.2亞型。Cav3.2在多種外周神經(jīng)纖維中都有表達,如,皮膚傳入纖維的軸突、外周傷害性感受器的神經(jīng)末梢、Aδ纖維的郎飛結(jié)、脊髓背角中傷害性感受纖維的突觸前末端。有研究表明,鞘內(nèi)注射反義核苷酸敲低背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中的Cav3.2亞型可以顯著降低神經(jīng)痛和炎性痛模型的疼痛反應(yīng);T型鈣通道的阻斷劑在鋸齒類動物疼痛模型中發(fā)揮顯著的鎮(zhèn)痛作用。T型鈣通道幾種亞型已被作為臨床鎮(zhèn)痛藥物作用靶點研究了很長時間,且目前有幾種新型的T型鈣通道特異性阻斷劑作為鎮(zhèn)痛藥物已進入臨床試驗階段。相反,如果痛覺通路中的T型鈣通道通道活性增加或者表達量增加可以引起痛覺增敏現(xiàn)象。在許多病理性疼痛(如,糖尿病神經(jīng)病變,外周神經(jīng)損傷或炎癥反應(yīng))中,均表現(xiàn)出T型鈣電流表達增加。雖然緩激肽(Bradykinin,BK)、三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)、去甲腎上腺素(Norepinephrine bitartrate,NE)和前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)是已知的可以引起疼痛的炎性物質(zhì),但至今沒有系統(tǒng)研究這些內(nèi)源性物質(zhì)對于T型鈣通道的調(diào)節(jié)作用,及其調(diào)節(jié)作用下的作用機制的報道。本研究第一部分將集中研究這四種內(nèi)源性炎性物質(zhì)對于急性分離培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中的T型鈣通道的調(diào)節(jié)作用,及其產(chǎn)生相應(yīng)調(diào)節(jié)作用的機制。P物質(zhì)(SP)是一種十一個氨基酸多肽,屬于速激肽家族,在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均有表達。SP是一種主要的興奮性遞質(zhì),其可參與痛覺傳遞、肌肉收縮、炎性調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答等過程。SP可被哺乳動物外周軀體感覺系統(tǒng)的傷害性感覺神經(jīng)元中的TRPV1陽性細胞所大量產(chǎn)生。當中樞或外周受到傷害性刺激時均會釋放SP。外周傷害性神經(jīng)纖維末端釋放SP引起所謂的“神經(jīng)性炎癥”,在脊髓背角SP促進興奮性遞質(zhì)谷氨酸釋放。SP通過激活NK1(一種G蛋白偶聯(lián)受體)受體發(fā)揮胞內(nèi)作用。目前尚未見有關(guān)SP調(diào)節(jié)T型鈣通道功能的報道。越來越多的證據(jù)表明,T型鈣通道可被氧化還原機制所調(diào)節(jié),L-型半胱氨酸等還原性物質(zhì)可以顯著性增大外周神經(jīng)系統(tǒng)DRG神經(jīng)元中的T型鈣電流,抗壞血酸和N2O等可促進細胞釋放ROS的物質(zhì)可以抑制DRG神經(jīng)元中的T型鈣電流等。另外具有自由電子的活性氮也可以通過氧化還原作用調(diào)節(jié)T型鈣通道功能。但至今為止,人們對這些氧化還原調(diào)節(jié)下的分子調(diào)節(jié)機制了解并不深刻。這也成為了T型鈣通道更深入研究的瓶頸。本研究第二部分主要是利用大鼠背根神經(jīng)元以及人胚腎上皮(HEK)細胞研究SP對T型鈣電流,尤其是Cav3.2亞型的調(diào)節(jié)作用及其作用機制。因為P物質(zhì)在脊髓痛覺通路中強大的興奮性作用,針對NK1受體拮抗劑的新型鎮(zhèn)痛藥物的研究方興未艾。然而,盡管有許多強有力的臨床前數(shù)據(jù)被報道,但NK1受體拮抗劑的臨床實驗均以失敗告終。導(dǎo)致這一困惑的原因可能與SP在中樞和外周有不同作用有關(guān),即不同于其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮作用,SP在外周傷害性通路中可能存在抑制性或鎮(zhèn)痛作用。本研究第三部分部分我們將圍繞這個問題展開研究,通過傳統(tǒng)的電生理手段研究S9SP(一種NK1受體激動劑)、Z944(T型鈣通道特異性阻斷劑)、ST101(T型鈣通道特異性開放劑)對外周神經(jīng)元DRG興奮性的調(diào)節(jié),并研究這些藥物在整體動物疼痛中的調(diào)節(jié)作用。論文具體內(nèi)容如下:第一部分內(nèi)源性炎性物質(zhì)緩激肽、三磷酸腺苷、去甲腎上腺素、前列腺素2對DRG神經(jīng)元中T型鈣通道的作用目的:研究幾種內(nèi)源性炎性物質(zhì)對DRG中T型鈣通道的調(diào)節(jié)及其作用機制。方法:1急性分離培養(yǎng)大鼠DRG神經(jīng)元,藥物孵育過夜。2利用膜片鉗技術(shù)、細胞免疫熒光技術(shù)和PCR技術(shù)研究幾種炎性物質(zhì)對T型鈣通道的調(diào)節(jié)及其作用機制。結(jié)果:1用緩激肽(BK,100 n M),三磷酸腺苷(ATP,2μM),去甲腎上腺素(NE,500 n M),前列腺素E2(PGE2,500 n M)的混合藥物(Inf.)過夜孵育培養(yǎng)第二天的成年雄性大鼠DRG神經(jīng)元。膜片鉗結(jié)果顯示炎性藥物混合劑孵育過夜后,與溶劑(DMEM)對照組比處理組DRG神經(jīng)元中表達T型鈣通道的細胞數(shù)量顯著性增加,從對照組的21/43(48.8%),上升到Inf.孵育組的31/42(73.8%)(P0.05)。但對平均電流峰值沒有顯著影響,平均電流大小分別為-113.6±18.5 p A(DMEM組)和-105.3±14.5 p A(Inf.組)。Inf.孵育24 h并沒有引起DRG神經(jīng)元凋亡。2 BK與ATP各自單獨過夜孵育也可引起T型鈣電流陽性細胞比例明顯增加,從對照組的25/54(46.3%)增加到43/54(79.6%,BK組)(P0.05)和39/56(69.9%,ATP組)(P0.05)。而NE和PGE2無此作用。且這些藥物孵育對T型鈣電流大小均無影響。3 PLC阻斷劑U-73122或B2受體阻斷劑Hoe-140孵育可阻斷Inf.孵育引起的T型鈣電流陽性細胞比例增大,而P2X2/P2X3阻斷劑A-317491并無此作用。4蛋白酶體抑制劑MG132(5μM)可降低通道蛋白泛素化,孵育細胞并不能引起T型鈣電流陽性細胞比例的增加。PCR結(jié)果顯示,炎性物質(zhì)單獨或共孵育后,DRG神經(jīng)元中Cav3.2亞型m RNA表達量并無明顯變化。細胞免疫熒光結(jié)果顯示,炎性物質(zhì)單獨或共孵育對DRG細胞中總的Cav3.2通道蛋白的表達并無影響。結(jié)論:1 BK和ATP孵育可引起DRG神經(jīng)元中T型鈣電流陽性細胞比例增加。2 BK和ATP的作用是通過激活Gq/11-PLC通路所致。第二部分P物質(zhì)對T型鈣通道的調(diào)節(jié)作用及機制的研究目的:研究SP(S9SP)對DRG神經(jīng)元中T型鈣通道的作用,應(yīng)用電生理和分子生物學(xué)手段研究S9SP產(chǎn)生作用的分子機制。方法:1使用電生理膜片鉗技術(shù)觀察S9SP對DRG神經(jīng)元和HEK細胞中過表達的T型鈣通道作用。2利用si RNA干擾技術(shù)及藥理學(xué)阻斷劑研究S9SP對T型鈣通道調(diào)節(jié)作用偶聯(lián)的G蛋白通路。3應(yīng)用多種內(nèi)源性或外源性藥物采用電生理技術(shù)、細胞鋅成像技術(shù)、原子分光光度法等技術(shù)研究S9SP引起T型鈣通道功能改變的分子機制。4利用藥理氧化劑及定點突變技術(shù)研究S9SP下游信號分子在通道蛋白上的具體作用位點。結(jié)果:1 S9SP可以濃度依賴性地抑制中、小直徑,痛覺相關(guān)的DRG神經(jīng)元中的T型鈣電流,IC50為6.20±2.99 n M。2 1μM S9SP可以產(chǎn)生最大抑制,抑制率為22.5±2.3%。一種NK1受體特異性激動劑Sar9-Met(O2)11-SP(1μM)可以對DRG神經(jīng)元中的T型鈣電流產(chǎn)生相似程度的抑制,抑制率為26.6±4.7%。NK1受體特異性拮抗劑CP-99994幾乎完全阻斷S9SP所引起的T型鈣電流的抑制。但S9SP對DRG神經(jīng)元中的高電壓激活鈣電流(HVA)并無影響。3 PTX預(yù)孵育過夜可完全阻斷S9SP引起的對DRG神經(jīng)元T型鈣電流的作用。使用si RNA將Gq和G11 m RNA水平敲低至基礎(chǔ)水平(轉(zhuǎn)染陰性對照si RNA)的20%左右,發(fā)現(xiàn)并未對S9SP的作用造成影響,其仍可對T型鈣電流產(chǎn)生27.1±3.8%的抑制;而當用si RNA敲低Gi和Go表達水平至基礎(chǔ)水平(轉(zhuǎn)染陰性對照si RNA)的20%左右時,S9SP對DRG神經(jīng)元中T型鈣電流的抑制作用則幾乎完全消除,抑制率僅為2.5±2.6%。同時發(fā)現(xiàn),PKC抑制劑BIM I并不能影響S9SP對T型鈣電流的抑制作用。4還原性物質(zhì)DTT(二硫蘇糖醇)幾乎完全逆轉(zhuǎn)S9SP引起的T型鈣電流的抑制作用;另外氧化性物質(zhì)H2O2和Antimycin A可以模擬S9SP對T型鈣電流的作用。5 Zn Cl2可著抑制T型鈣電流,抑制率為24.55±4.3%;鋅存在時S9SP不能引起T型鈣電流進一步的抑制。鋅螯合劑TPEN可消除S9SP對T型鈣電流的抑制作用,并可逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的抑制作用。6共聚焦鋅成像和原子吸收分光光度法實驗表明,S9SP孵育細胞并不能改變細胞內(nèi)/外鋅濃度。7 S9SP存在時可增大低濃度鋅對Cav3.2電流的抑制作用。8氨基酸點突變實驗表明,Cav3通道上鋅的高親和位點在S9SP引起的Cav3電流抑制作用中至關(guān)重要。9利用兩種氧化劑NEM(透膜的氧化劑)和MTSES(不透膜的氧化劑)的實驗發(fā)現(xiàn),MTSES能抑制表達于HEK293細胞的Cav3.2電流,且作用特點與S9SP相似;而NEM呈現(xiàn)非特異性抑制作用。10將Cav3.2中S1-S2胞外連接的三個連接環(huán)上的半胱氨酸和S1跨膜區(qū)的一個半胱氨酸突變?yōu)楸彼岷蟀l(fā)現(xiàn),這四個位點的突變顯著性降低了MTSES對突變通道電流的抑制作用。結(jié)論:1 S9SP激活DRG神經(jīng)元中NK1受體進而激活Gi/o信號通路,抑制T型鈣通道;2 S9SP誘導(dǎo)內(nèi)源性釋放ROS從而通過ROS通路抑制T型鈣電流。3 ROS調(diào)節(jié)通道對鋅的親和力,進而抑制T型鈣電流;4同源區(qū)域I中的S1-S2連接片段中的一個或幾個半胱氨酸介導(dǎo)了Cav3.2的氧化還原作用。第三部分SP對T型鈣通道的調(diào)節(jié)在神經(jīng)元興奮性及外周疼痛中作用的研究目的:研究SP介導(dǎo)的T型鈣通道的調(diào)節(jié)在大鼠DRG神經(jīng)元興奮性及動物疼痛行為中的作用。方法:1使用電流鉗技術(shù),研究T型鈣通道特異性阻斷劑Z944、T型鈣通道特異性開放劑ST101和NK1受體激動劑S9SP對DRG神經(jīng)元興奮性的影響。2動物疼痛模型由大鼠腳掌注射緩激肽(BK)、機械刺激或熱源刺激所造成。在這些疼痛模型上觀察腳掌注射Z944、S9SP和ST101對疼痛行為的影響。3鞘內(nèi)注射反義核苷酸敲低大鼠DRG(L4-L6)中的Cav3.2表達水平,進一步研究T型鈣通道在S9SP對疼痛行為影響中的作用。結(jié)果:1 Z944可以顯著增加動作電位的rheobase,減少動作電位(AP)個數(shù),并且使靜息膜電位(Erest)超極化,但對AP峰值和AP持續(xù)時間沒有顯著影響。相反,ST101可以顯著增加動作電位爆發(fā)次數(shù)并使Erest去極化,同樣對AP峰值和AP時程沒有顯著影響。S9SP對DRG神經(jīng)元興奮性的影響與Z944作用趨勢相同,雖然只有對rheobase的作用達到了統(tǒng)計學(xué)差異。si RNA敲低培養(yǎng)DRG神經(jīng)元中Cav3.2表達可以消除Z944和ST101對神經(jīng)元興奮性的影響。2 BK單獨灌流可以顯著降低rheobase,增加動作電位爆發(fā)個數(shù),使Erest去極化。S9SP和Z944則可抑制BK的作用,都幾乎使BK引起的rheobase降低和動作電位個數(shù)增加恢復(fù)至原來水平。3大鼠腳掌分別注射0.02μM,0.2μM,2μM和200μM ST101可以引起明顯的疼痛反應(yīng)。4大鼠腳掌注射Z944(1μM,10μM,100μM)三個不同濃度均可顯著性增加大鼠熱痛閾值。5大鼠腳掌注射S9SP可以顯著降低大鼠腳掌對輕觸覺的反應(yīng),Z944腳掌注射產(chǎn)生相似的作用;大鼠腳掌注射ST101可以增加大鼠腳掌對輕觸覺的敏感程度。6提前注射RTG(M-型鉀通道開放劑)或Z944可以顯著降低之后注射BK所引起的疼痛,預(yù)注射S9SP同樣顯著降低BK注射引起的疼痛反應(yīng)。RTG和Z944共同預(yù)注射可以引起與S9SP注射相似的鎮(zhèn)痛反應(yīng)。7利用反義核苷酸鞘內(nèi)注射敲低大鼠DRG中Cav3.2水平可以消除Z944引起的鎮(zhèn)痛作用,降低S9SP引起的鎮(zhèn)痛作用,提示T型鈣通道的參與。結(jié)論:1 T型鈣通道開放劑ST101可增加神經(jīng)元興奮性,而T型鈣通道阻斷劑Z944和S9SP可降低神經(jīng)元興奮性;ST101和Z944的作用是通過調(diào)節(jié)T型鈣通道功能產(chǎn)生的。Z944和S9SP可以拮抗BK引起的DRG神經(jīng)元興奮性的增加。2 ST101引起大鼠自發(fā)性疼痛;Z944和S9SP可拮抗BK注射引起的疼痛。3 Cav3.2介導(dǎo)了Z944引起的鎮(zhèn)痛作用,介導(dǎo)了部分S9SP的鎮(zhèn)痛作用。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Changma Fu;Zongsheng Yin;Defu Yu;Zuhua Yang;;Substance P and calcitonin gene-related peptide expression in dorsal root ganglia in sciatic nerve injury rats[J];Neural Regeneration Research;2013年33期

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本文編號：2317645