【摘要】：糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids,GCs)是腎上腺皮質(zhì)分泌的一種重要的激素,參與了機(jī)體多種物質(zhì)的代謝過程,對(duì)維持機(jī)體正常的生長發(fā)育及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等發(fā)揮重要的作用。同時(shí)糖皮質(zhì)激素還具有很強(qiáng)的抗炎、免疫抑制等重要的藥理作用,是臨床常用的藥物。另外,糖皮質(zhì)激素還是一種參與應(yīng)激的重要激素。然而大量研究顯示,長期反復(fù)的應(yīng)激或大劑量外源性糖皮質(zhì)激素的給予可使體內(nèi)GCs維持在較高水平,引起海馬神經(jīng)元的丟失和死亡,與阿爾茨海默癥(AD)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。然而,體內(nèi)高水平的糖皮質(zhì)激素對(duì)海馬神經(jīng)元損傷的機(jī)制還尚不完全清楚。第一部分:目的:研究慢性糖皮質(zhì)激素對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元NLRP-1炎癥小體激活的影響及機(jī)制,探討NLRP-1炎癥小體在慢性GCs誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的作用。方法:1.原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元到第5天,隨機(jī)分成對(duì)照組和地塞米松(DEX,5μM)組,各組再分為1d、3d、5d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。LDH試劑盒檢測海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況;Hoechst 33258染色測定海馬神經(jīng)元凋亡情況;Western blot檢測NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)變化;ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18的含量變化。2.原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元到第5天,隨機(jī)分成6組:對(duì)照組,DEX(0.1,1,5μM)組,RU486(5μM)組和DEX(5μM)+RU486(5μM)組。LDH試劑盒檢測海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況;Hoechst 33258染色測定海馬神經(jīng)元凋亡情況;免疫熒光檢測GR和MAP2表達(dá)情況;Western blot檢測GR、ASC、NLRP-1、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)變化;ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18的含量變化;Q-PCR檢測NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的mRNA表達(dá)變化情況。結(jié)果:1.與對(duì)照組比較,DEX 5μM處理3、5d能明顯促進(jìn)海馬神經(jīng)元LDH的釋放;Hoechst 33258結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,DEX 5μM處理1、3、5d能明顯促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡,細(xì)胞核固縮或裂解呈碎塊狀;Western blot結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,DEX 5μM處理5d的海馬神經(jīng)元細(xì)胞MAP2表達(dá)明顯下降,DEX 5μM處理1、3d的海馬神經(jīng)元細(xì)胞NLRP-1,caspase-1 and IL-1β表達(dá)明顯增加。2.與對(duì)照組比較,DEX 1、5μM處理3d能明顯增加細(xì)胞上清液中LDH的含量,而RU486可抑制其增加。Hoechst 33258結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,DEX 5μM處理3d導(dǎo)致海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯。免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,DEX 1μM和5μM處理5d海馬神經(jīng)元MAP2的表達(dá)明顯降低;DEX 0.1,1和5μM處理3d能明顯減少海馬神經(jīng)元GR的表達(dá)。Western blot結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,DEX 0.1,1和5μM處理3d能明顯減少海馬神經(jīng)元GR的表達(dá)以及明顯增加NLRP-1和ASC的表達(dá);DEX 0.1μM處理3d能明顯減少海馬神經(jīng)元caspase-1和IL-1β的表達(dá),DEX5μM處理3d的海馬神經(jīng)元caspase-1和IL-1β表達(dá)明顯增加;DEX 1μM和5μM處理3d可明顯下調(diào)海馬神經(jīng)元NF-κB的表達(dá);與DEX 5μM組比較,RU486能明顯抑制DEX誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元caspase-1和IL-1β表達(dá)增高。ELISA結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,DEX 1和5μM處理3d能明顯增加海馬神經(jīng)元細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的含量,而RU486能明顯減少IL-1β和IL-18的釋放。第二部分:目的:研究慢性糖皮質(zhì)激素對(duì)海馬神經(jīng)元BK-NLRP1信號(hào)通路的影響,探討B(tài)K-NLRP1信號(hào)通路在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷中的作用,以便為AD的防治提供新的思路和靶點(diǎn)。方法:1.原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元到第5天,隨機(jī)分成4組:對(duì)照組,DEX(5μM)組,Iberiotoxin(IbTx,0.2μM)組和DEX(5μM)+IbTx(0.2μM)組。LDH試劑盒檢測海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況;Hoechst 33258染色測定海馬神經(jīng)元凋亡情況;免疫熒光檢測MAP-2蛋白表達(dá)的變化;Western blot檢測MAP2、BK、NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)變化;ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18的含量變化;Q-PCR檢測NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的mRNA表達(dá)變化;采用離子選擇電極法檢測海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鉀離子的濃度;全細(xì)胞膜片鉗方法觀察DEX和IbTx對(duì)海馬神經(jīng)元大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large conductance calcium activated potassium channel channel,BK)電流變化的影響。2.雄性小鼠分為對(duì)照組,DEX(5mg/kg)組,各組再分為7d、14d、21d、28d四個(gè)時(shí)點(diǎn)。Western blot和Q-PCR檢測小鼠海馬組織中BK mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.與對(duì)照組比較,IbTx能明顯減少DEX誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的LDH釋放;IbTx也能抑制DEX誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡。Western blot結(jié)果表明,與DEX 5μM組比較,IbTx能明顯減少DEX誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元NLRP1,ASC,caspase-1和IL-1β的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示,與DEX 5μM組比較,IbTx能明顯減少DEX誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的MAP2的表達(dá)。ELISA結(jié)果表明,與DEX 5μM組比較,IbTx能明顯抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的釋放。全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示,DEX(5μM)可以增大海馬神經(jīng)元BK通道電流大小,降低細(xì)胞內(nèi)鉀離子的濃度,IbTx可抑制這一效應(yīng)。2.Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,DEX 5mg/kg處理7,21和28天小鼠海馬和皮層組織內(nèi)BK表達(dá)明顯增加。Q-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,DEX5mg/kg處理21天和28天小鼠皮層和海馬組織內(nèi)BK表達(dá)水平明顯增加。結(jié)論:1.慢性GCs暴露可能通過下調(diào)海馬神經(jīng)元GR表達(dá),激活NLRP-1炎性小體,增加海馬神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷。2.慢性GCs誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷可能與上調(diào)海馬神經(jīng)元BK通道表達(dá),增加BK通道電流,導(dǎo)致海馬神經(jīng)元[K+]i降低,進(jìn)而激活海馬神經(jīng)元NLRP-1炎癥小體,促進(jìn)海馬神經(jīng)元損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

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