【摘要】：人口老齡化是指總?cè)丝谥心贻p人口數(shù)量減少、年長人口數(shù)量增加而導(dǎo)致的老年人口比例相應(yīng)增長的動態(tài),是20世紀(jì)下半期到21世紀(jì)初出現(xiàn)的一個(gè)世界性問題。目前世界老齡人口,即60歲及以上的人口達(dá)到7.5億。到2050年,預(yù)計(jì)老齡人口將達(dá)到20億,并且80%的老年人將生活在發(fā)展中國家。2013年,我國60歲以上老年人口已達(dá)到2.02億,占全國總?cè)丝诘?4.8%；預(yù)計(jì)到2015年和2020年,這一比例將分別達(dá)到15%和18%。通常,65歲以上的人口比率超過總?cè)丝诘?%,就被稱為“老齡化社會”,而超過了14%就被稱為“老齡社會”。世界上所有發(fā)達(dá)國家都已經(jīng)進(jìn)入老齡社會,許多發(fā)展中國家正在或即將進(jìn)入老齡社會。中國在1999年已進(jìn)入“老齡社會”,隨之而來的問題是老年人的健康狀況不容樂觀,老年人對于醫(yī)療、保健、護(hù)理以及生活服務(wù)的需求大大超過其他人。因此倡導(dǎo)健康老齡化,促進(jìn)老齡人口的健康是醫(yī)療工作者和社會的使命。理論上抗衰老治療可以改變衰老引起的生化和分子學(xué)方面的變化,糾正衰老相關(guān)的生理學(xué)變化,減少對衰老相關(guān)疾病的易感性。美國抗衰老醫(yī)學(xué)學(xué)會(American Academy of Anti-Aging Medicine, A4M)宣稱：“衰老相關(guān)的能力喪失由機(jī)體的生理功能障礙引起,許多情況下這些功能障礙可被內(nèi)科治療所改善。人類的壽命可望延長,老年人的生活質(zhì)量可望改善”。人類的衰老是可以被解釋并且可能被延緩的,尋找延緩衰老的分子靶點(diǎn)并加以干預(yù)是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。 因?yàn)槿砀髌鞴俳M織的正常工作有賴于循環(huán)系統(tǒng)的正常供血,而血管的正常功能在維持循環(huán)系統(tǒng)的正常運(yùn)行中發(fā)揮著不可或缺的作用,所以衰老過程中血管功能的改變將極大地影響著人體整體的機(jī)能。隨著機(jī)體的衰老,血管也相應(yīng)地衰老,表現(xiàn)為血管結(jié)構(gòu)和功能的改變。增齡性血管功能障礙與內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān),表現(xiàn)為阻力和傳導(dǎo)動脈的內(nèi)皮依賴性血管舒張能力進(jìn)行性下降。因?yàn)檠軆?nèi)皮功能障礙是一個(gè)系統(tǒng)性的功能紊亂,并且是動脈粥樣硬化、冠心病和高血壓病的一個(gè)關(guān)鍵因素,因此改善內(nèi)皮功能障礙能夠減少心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率。雖然離體實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)抑制血管細(xì)胞衰老能夠改善細(xì)胞功能障礙,但是在體的研究仍然需要進(jìn)一步探討。 他汀作為3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase, HMG-CoA reductase)抑制劑,除具有調(diào)脂作用外,還可以改善血管內(nèi)皮功能障礙,從而防治一系列的血管相關(guān)疾病,如動脈粥樣硬化、冠心病和高血壓等。盡管如此,之前的研究主要是離體實(shí)驗(yàn),或者短期的他汀干預(yù)急性病理血管功能障礙模型�？紤]到衰老過程中緩慢而微小的病理變化需要長期的累積才能造成明顯的功能改變,建立一個(gè)自然衰老動物模型將能夠更好地研究他汀對于增齡性血管功能障礙的影響。 幾個(gè)信號通路已經(jīng)被證實(shí)參與血管衰老以及他汀的抑制效應(yīng)。一氧化氮(NO)被公認(rèn)為調(diào)節(jié)血管功能的關(guān)鍵信號分子。NO由一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase, NOS)合成,而一氧化氮合成酶有三種同分異構(gòu)體,分別為內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial Nitric oxide synthase, eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible Nitric oxide synthase, iNOS)和神經(jīng)型一氧化氮合成酶(neuronal Nitric oxide synthase, nNOS)。NO對于血管功能的影響取決于它所處的環(huán)境,包括NO的來源和數(shù)量。eNOS以及eNOS來源的NO是鈣依賴性的,并發(fā)揮有益的作用,但是隨著衰老而下降。iNOS以及iNOS來源的NO是非鈣依賴性的,并發(fā)揮有害的作用,但是隨著衰老而上升。生理情況下eNOS合成的NO使血管舒張,從而維持正常血管功能。在病理情況下,iNOS被激活而產(chǎn)生大量NO。一方面,過量NO與活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)相互作用,形成亞硝酸鹽(Peroxynitrite, ONOO-),進(jìn)而誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化而加速血管衰老,最終導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。另一方面,iNOS來源的NO激活精氨酸酶I,使eNOS底物降解,導(dǎo)致eNOS的失偶聯(lián)而造成血管功能障礙。衰老過程中,主動脈中的iNOS被激活或上調(diào),但是對于iNOS的確切位置和來源依然值得研究。他汀對于NOS同分異構(gòu)體的作用也存在爭議,特別是對于iNOS的影響。因?yàn)樽匀凰ダ蟿游锬Ｐ托枰L期的干預(yù)和觀察,他汀對于自然衰老動物模型內(nèi)皮功能障礙的研究甚少,需要進(jìn)一步研究。 SIRT1(Sirtuin-1)是一個(gè)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的組蛋白,能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞衰老和血管功能。SIRT1也能夠與eNOS相互作用,并刺激eNOS的表達(dá)從而抑制血管細(xì)胞衰老和改善內(nèi)皮功能障礙。雖然離體實(shí)驗(yàn)證實(shí),阿托伐他汀可以通過誘導(dǎo)SIRT1抑制細(xì)胞衰老,但是阿托伐他汀是否可以同樣通過誘導(dǎo)SIRT1而抑制血管老化仍值得探討。 基于以上觀點(diǎn)和研究現(xiàn)狀,我們假設(shè)衰老過程中血管將出現(xiàn)功能障礙,阿托伐他汀的長期干預(yù)治療可以改善血管功能障礙,并且是通過調(diào)節(jié)增齡性變化過程的氧化應(yīng)激損傷以及NOS系統(tǒng)的失衡的結(jié)果。同時(shí),基于SIRT1在血管功能中發(fā)揮的作用,我們假設(shè)SIRT1也能夠與NOS系統(tǒng)相互作用,而參與血管功能的改變以及他汀的干預(yù)效應(yīng)。本課題組前期研究顯示,不同年齡段的Wistar大鼠通過長期飼養(yǎng),血管出現(xiàn)一系列的病理變化,包括氧化應(yīng)激損傷和eNOS的下調(diào)。這些增齡性變化提示大鼠血管發(fā)生了衰老,因此該模型可作為良好的自然衰老動物模型。本研究采用改進(jìn)的動物模型,采用各個(gè)年齡段雄性Wistar大鼠長期喂養(yǎng),作為自然衰老模型。本研究圍繞以下三個(gè)方面進(jìn)行,不但可以回答上述提出的假設(shè)問題,同時(shí)可以探討阿托伐他汀改善內(nèi)皮功能障礙的作用是否通過其經(jīng)典的NOS系統(tǒng),以及對于SIRT1的影響。 一、大鼠血管增齡性內(nèi)皮功能障礙以及阿托伐他汀的干預(yù)作用 本研究以目前公認(rèn)的反映血管功能的兩項(xiàng)指標(biāo)：內(nèi)皮依賴性的血管功能檢查(乙酰膽堿誘導(dǎo)的血管舒張能力檢測)以及非內(nèi)皮依賴性的血管功能檢查(硝普鈉誘導(dǎo)的血管舒張能力檢測)為主要觀察指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)分4組：青年對照組(2月齡雄性Wistar大鼠,n=8),中年對照組(4月齡雄性Wistar大鼠喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料,飼養(yǎng)至12月齡,n=8),老年對照組(12月齡雄性Wistar大鼠喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料,飼養(yǎng)至20月齡,n=8,飼養(yǎng)至19月齡時(shí),死亡1只),阿托伐他汀干預(yù)組(12月齡雄性Wistar大鼠喂養(yǎng)添加阿托伐他汀(5mg/kg·d)的飼料,飼養(yǎng)至20月齡,n=8)。飼養(yǎng)8個(gè)月后,開胸取胸主動脈,測定上述指標(biāo)。結(jié)果顯示：青年組、中年對照組和老年對照組之間的比較發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能隨著年齡增長而下降(P0.05或者0.01),非內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能隨著年齡增長無變化(P0.05)。這提示增齡導(dǎo)致了大鼠血管內(nèi)皮功能障礙。 此外,長期的阿托伐他汀干預(yù)對血管功能影響顯示：與老年對照組相比,長期的阿托伐他汀干預(yù)后,內(nèi)皮依賴性舒張能力得到了提高(P0.05或者0.01),非內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能無變化(P0.05)。提示長期的阿托伐他汀治療可改善增齡相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙。二、血管增齡性內(nèi)皮功能障礙以及阿托伐他汀的干預(yù)的機(jī)制 為了進(jìn)一步探討血管增齡性的內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生機(jī)制以及阿托伐他汀的干預(yù)機(jī)制,我們觀察了自然衰老組和阿托伐他汀干預(yù)組大鼠主動脈氧化應(yīng)激損傷以及NO通路相關(guān)指標(biāo)變化。氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)：比色法測超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量。NO通路相關(guān)指標(biāo)：Griess法檢測總NO含量,以及鈣依賴性的NOS活性以及非鈣依賴性的NOS活性。Real-time定量PCR法測定eNOS和iNOS的mRNA含量,Western-blotting法檢測NOS和iNOS的蛋白表達(dá),免疫組化法定位檢測eNOS和iNOS的表達(dá)。結(jié)果顯示：(1)青年組、中年對照組和老年對照組的兩兩比較,隨著年齡增長,SOD活性下降(P0.05或者0.01),MDA含量升高(P0.01),總NO含量下降(P0.05或0.01),鈣依賴性NOS活性隨著年齡增長而下降(P0.01),而非鈣依賴性NOS活性隨著年齡增長而上升(P0.01)。與中年對照組比較,老年對照組的eNOS的表達(dá)顯著降低(P0.01),iNOS的表達(dá)顯著升高(P0.01), eNOS/iNOS比值顯著降低(P0.01)。雖然青年對照組eNOS表達(dá)不大于中年對照組,但是青年對照組未檢測至iNOS的mRNA和蛋白的表達(dá)。這意味著eNOS/iNOS比例隨著增齡過程而下降。這提示增齡導(dǎo)致血管氧化應(yīng)激損傷和NOS系統(tǒng)失衡。(2)與老年對照組比較,長期阿托伐他汀干預(yù)可增加SOD含量(P0.01),減少M(fèi)DA含量(P0.01),增加總NO含量(P0.01),提高鈣依賴性的NOS活性而降低非鈣依賴性的NOS活性(P0.01)。通過增加‘NOS的表達(dá)(P0.01)和抑制iNOS的表達(dá)(未檢測到)而恢復(fù)eNOS/iNOS比例。這提示長期阿托伐他汀干預(yù)可以減弱氧化應(yīng)激損傷和恢復(fù)NOS系統(tǒng)的平衡。(3)免疫組化結(jié)果顯示eNOS只表達(dá)在主動脈內(nèi)膜(內(nèi)皮細(xì)胞)上,而iNOS表達(dá)在內(nèi)膜和中膜(血管平滑肌細(xì)胞)上,并且青年對照組和老年阿托伐他汀組均未檢測至JiNOS的表達(dá)。這提示iNOS隨著增齡而被激活,同時(shí)長期阿托伐他汀干預(yù)可以抑制iNOS的表達(dá)而恢復(fù)NOS系統(tǒng)的平衡。 三、SIRT1在血管增齡性內(nèi)皮功能障礙及阿托伐他汀的干預(yù)的作用初探 為了探討SIRT1在血管老化中的作用以及以及阿托伐他汀對SIRT1的影響。我們觀察了各組大鼠主動脈SIRT1的變化。Real-time定量PCR法測定SIRT1mRNA含量,Western-blotting法檢鋇HSIRT1的蛋白定量表達(dá),免疫組化法定位檢測HSIRT1的表達(dá)。為了分析SIRT1與NOS系統(tǒng)的相互作用對于血管老化的影響,以及在阿托伐他汀干預(yù)中所起的作用,我們將SIRT1和NOS系統(tǒng)進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示:(1)青年對照組、中年對照組和老年對照組之間的多重比較顯示,與中年對照組比較,老年對照組的SIRT1表達(dá)下降(P0.01)。雖然青年對照組的SIRT1表達(dá)并不大于中年對照組,但是其表達(dá)高于老年對照組(P0.01)。這提示SIRT1的表達(dá)隨著衰老而降低。與其他組相比,老年阿托伐他汀組的SIRT1表達(dá)增加(P0.01)。免疫組化顯示SIRT1同時(shí)表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞上。這提示長期的阿托伐他汀干預(yù)可以上調(diào)胸主動脈SIRT1的表達(dá)。(2)胸主動脈SIRT1與NOS的相關(guān)性分析顯示,在所有組中,eNOS的表達(dá)與SIRT1的表達(dá)成顯著正相關(guān)關(guān)系(P0.01),相關(guān)系數(shù)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分別達(dá)到0.956和0.523。iNOS的表達(dá)與SIRT1的表達(dá)成顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P0.05或者P0.01),相關(guān)系數(shù)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分別達(dá)到-0.614和.0.872。eNOS/iNOS比例與SIRT1的表達(dá)成顯著正相關(guān)關(guān)系(P0.01),相關(guān)系數(shù)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分別達(dá)到0.987和0.905。因?yàn)閕NOS僅僅在中年對照組和老年對照組被檢測到,所以涉及iNOS的相關(guān)性分析只在這兩組進(jìn)行。盡管如此,考慮到青年對照組和老年阿托伐他汀組eNOS的相對高表達(dá),并且該兩組并未檢測至iNOS的表達(dá),所以可以合理推測該兩組eNOS/iNOS比例與SIRT1的表達(dá)也是成顯著正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論： 通過本研究,我們能夠得出以下結(jié)論： 1.增齡過程中,雄性Wistar大鼠出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能障礙,提示衰老可以引起內(nèi)皮功能障礙。衰老可通過增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激,下調(diào)eNOS,激活并上調(diào)iNOS引起NOS系統(tǒng)失衡,造成NO生物利用度下降,最終導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。 2.長期阿托伐他汀(5mg/kg-d)干預(yù)可改善內(nèi)皮功能障礙。其機(jī)制涉及減弱氧化應(yīng)激損傷,上調(diào)eNOS,抑制iNOS而恢復(fù)NOS系統(tǒng)平衡,提高NO生物利用度,從而改善血管內(nèi)皮功能障礙。 3.增齡過程中,血管老化伴隨著SIRT1表達(dá)下調(diào),且和NOS系統(tǒng)的平衡密切相關(guān)。阿托伐他汀可能通過上調(diào)SIRT1而維持NOS系統(tǒng)平衡而改善血管內(nèi)皮功能障礙。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2304471