【摘要】：臨床用藥引起的藥物毒副作用一直是困擾廣大患者和醫(yī)療工作者的重要問題,這其中不乏一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)。例如,長期或大量使用非甾體抗炎藥(NSAIDs)會造成胃腸道的損傷,導(dǎo)致胃腸道潰瘍、糜爛、出血、穿孔等;長期或大量使用對乙酰氨基酚(APAP)會引起肝腎損傷,導(dǎo)致肝腎功能異常。廣泛研究表明,組織損傷部位局部微環(huán)境存在異常升高的活性氧(ROS),導(dǎo)致氧化應(yīng)急水平的增高,氧化與抗氧化能力的失調(diào),產(chǎn)生過氧化反應(yīng),從而進(jìn)一步加重組織損傷。因此,降低組織損傷部位的氧化應(yīng)激水平,清除自由基成為治療藥物引起的副作用的新方式。然而,口服小分子藥物的傳統(tǒng)制劑往往導(dǎo)致藥物的非特異性組織分布,且小分子藥物的體內(nèi)半衰期較短,需頻繁給藥,故多數(shù)情況下防治效果并不理想,且可能引起新的不良反應(yīng)。近期研究表明,納米藥物由于其特殊的納米尺寸效應(yīng),可以在組織損傷部位特異性分布,有效增加藥物引起的組織損傷的防治作用,并顯著降低副作用。但目前該領(lǐng)域研究的大多數(shù)納米系統(tǒng)在體內(nèi)降解和代謝清除方面存在一定問題,影響了其長期使用的安全性。為解決上述問題,本課題擬通過構(gòu)建具有過氧化氫(H_2O_2)清除能力的載體材料,裝載具有自由基清除功能的4-羥基TEMPO(Tpl),自組裝形成納米粒。該納米粒具有ROS響應(yīng)性,可靶向到氧化應(yīng)激水平升高的組織損傷部位,并在ROS的作用下,水解釋放出Tpl,達(dá)到對藥物引起的組織損傷的靶向治療作用。方法1.H_2O_2清除性載體材料的合成與表征將9.44 mmol的N,N-羰基二咪唑(CDI)與4.72 mmol的4-羥甲基苯硼酸頻哪醇酯(PBAP)溶于無水二氯甲烷(DCM)中,25℃攪拌1 h,用去離子水和飽和Na Cl溶液各洗3次,再用Na_2SO_4干燥30 min。過濾、干燥濾液,得到CDI活化的PBAP(CDI-PBAP)。將1.52 g的CDI-PBAP溶解于二甲基亞砜(DMSO)中,再加入250 mg的β-環(huán)糊精(β-CD)和0.8 g的4-二甲氨基吡啶(DMAP),25℃磁力攪拌過夜,加入去離子水沉淀,離心,去離子水清洗沉淀3次,-80℃凍干沉淀,即得到具有H_2O_2清除性的β-CD材料(Ox-bCD)。用傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR Spectrometer)和核磁共振波譜儀對Ox-bCD進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。2.空白納米粒的制備卵磷脂和二硬脂�；字Ｒ掖及�-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)溶于無水乙醇并分散在水中,65℃攪拌1 h。將溶于無水甲醇中的Ox-bCD滴加到上述溶液中,室溫攪拌2 h,10000 rpm離心10 min,得到空白納米粒(NPs)。測定其粒徑大小及表面電位,利用透射電鏡(TEM)對納米粒的形貌進(jìn)行表征。3.空白納米粒水解性能的評價將5 mg的NPs分別加入到磷酸緩沖鹽溶液(PBS)和不同濃度的H_2O_2溶液中,通過紫外可見分光光度計測其透光率。4.ROS清除性載藥納米粒的制備卵磷脂和DSPE-PEG2000溶于無水乙醇中,65℃攪拌1 h。將溶于無水甲醇中的Ox-bCD和Tpl滴加到上述溶液中,室溫攪拌2 h,10000 rpm離心10 min,得到載藥納米粒(Tpl-NPs)。測定其粒徑大小及表面電位,利用TEM對納米粒的形貌進(jìn)行表征,高效液相(HPLC)測其載藥量。5.ROS清除性納米粒的體外釋放評價配制pH 1.2的PBS溶液及p H 7.4的PBS溶液分別模擬胃腸道的酸堿環(huán)境,將載藥納米粒Tpl-NPs置于此模擬環(huán)境中,于特定時間取釋放液。通過HPLC測Tpl的釋放量。6.體外ROS清除性能測定配制30 m M的H_2O_2溶液,并用此溶液配制0.064、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/m L的Tpl-NPs(或Ox-bCD)溶液,37℃孵育48 h后測定溶液中剩余的H_2O_2的量,并繪制清除H_2O_2曲線。同時,配制0.064、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/m L的Tpl-NPs(或Ox-bCD)溶液,按照抗超氧陰離子自由基試劑盒說明書進(jìn)行檢測,并繪制抗超氧陰離子活力單位曲線。7.口服ROS清除性納米粒在NSAIDs引起的胃腸損傷小鼠體內(nèi)的分布研究卵磷脂和DSPE-PEG2000溶于無水乙醇中,65℃攪拌1 h。將溶于無水甲醇中的Ox-bCD和花青素染料7.5(Cy7.5)滴加到上述溶液中,室溫攪拌2 h后,10000 rpm離心10 min,得到裝載Cy7.5的納米粒(Cy7.5-NPs),測定其粒徑大小及表面電位,利用透射電鏡(TEM)對納米粒的形貌進(jìn)行表征�？诜﨏y7.5-NPs后,于不同時間點處死小鼠并解剖小鼠取胃、空腸、回腸、結(jié)直腸,用活體成像系統(tǒng)觀察并統(tǒng)計熒光強(qiáng)度。8.口服ROS清除性納米粒治療NSAIDs引起的胃腸損傷的藥效學(xué)評價雄性Balb/c小鼠禁食12 h后,通過口服吲哚美辛(IND)建立NSAIDs介導(dǎo)的胃腸損傷模型,在口服吲哚美辛前1 h口服生理鹽水、Tpl、NPs、Tpl-NPs、鋁碳酸鎂。12 h后取胃、空腸、回腸做蘇木精-伊紅(HE)染色切片,胃、空腸、回腸的組織勻漿液測定過氧化氫酶(CAT)、過氧化氫(H_2O_2)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)、IL-1β、IL-10、TNF-α的含量。9.口服ROS清除性納米粒對NSAIDs引起的胃腸損傷的生存率評價雄性Balb/c小鼠口服生理鹽水、Tpl、NPs、Tpl-NPs、鋁碳酸鎂,1 h后口服吲哚美辛。以此方式連續(xù)給藥10天,每天觀察其生存狀態(tài),統(tǒng)計其死亡個數(shù)。10.靜脈注射ROS清除性納米粒對APAP引起的肝損傷的初步藥效學(xué)評價雄性C57小鼠禁食15-18 h,通過腹腔注射對乙酰氨基酚(APAP)建立急性肝損傷模型,并給與正常飼養(yǎng),6 h后尾靜脈注射生理鹽水、Tpl-NPs,12 h后取肝臟做HE染色切片,肝臟的組織勻漿液測定H_2O_2、MDA、MPO、IL-1β、IL-10和TNF-α的含量。11.ROS清除性納米粒在細(xì)胞水平的初步安全性評價將巨噬細(xì)胞(RAW264.7)種植于孔板,與含血清培養(yǎng)基配制的納米粒溶液共孵育12或24 h后,MTT法測定細(xì)胞存活率。12.ROS清除性納米粒的體外溶血實驗提取雄性大鼠的紅細(xì)胞,與不同濃度Tpl-NPs渦旋混合后,室溫放置2 h,離心取上清,加到96孔板進(jìn)行血紅蛋白的含量測定。13.口服ROS清除性納米粒的初步安全性評價通過一次性口服2.5 g/kg、5.0 g/kg的Tpl-NPs,每兩天記錄一次體重,兩周后取全血測血常規(guī),取血清測腎功能、肝功能,取各臟器及胃、十二指腸、空腸、回腸做HE染色切片,并統(tǒng)計臟器指數(shù)。結(jié)果1.通過設(shè)計得到了具有H_2O_2清除性能的載體材料,核磁共振結(jié)果顯示β-CD上含有5個PBAP單元。2.基于納米沉淀法,成功的得到了空白納米粒和載藥納米粒,粒徑分別為136.9和146.1 nm,表面電位分別為為-30.9和-24.7 mV,其中Tpl-NPs中Tpl的載藥量約為15%。3.ROS清除性納米粒在PBS溶液中幾乎不水解,在不同濃度的H_2O_2溶液下水解率不同,且隨著H_2O_2濃度增大,水解率增大。在模擬胃腸道pH條件下,ROS清除性納米粒在pH 1.2的酸性介質(zhì)中藥物釋放緩慢,而在p H 7.4和H_2O_2共同存在的條件下釋放較為迅速。4.ROS清除性能實驗表明,Tpl-NPs(Ox-bCD)清除H_2O_2呈線性關(guān)系,抗超氧陰離子活力單位呈曲線,在一定范圍內(nèi)呈線性。5.活體成像結(jié)果顯示,口服Cy7.5-NPs后,Cy7.5在胃腸損傷模型組中比正常小鼠組中聚集的時間更長,熒光強(qiáng)度也更強(qiáng)。6.基于胃腸損傷模型的藥效學(xué)實驗結(jié)果顯示,口服Tpl-NPs后,胃、空腸、回腸部位的氧化應(yīng)激水平降低,生存率提高,通過HE染色組織切片結(jié)果看到組織損傷減小。7.在肝損傷模型中,靜脈注射Tpl-NPs對APAP引起的肝臟損傷起到了治療與保護(hù)作用。8.初步安全性結(jié)果顯示,Tpl-NPs對RAW264.7巨噬細(xì)胞無明顯毒性;同時對紅細(xì)胞無溶血現(xiàn)象�？诜邉┝縍OS清除性納米粒未見血常規(guī)、腎功能和肝功能的改變;HE染色組織切片未見臟器及胃、十二指腸、空腸、回腸部位病理性變化。結(jié)論1.通過將PBAP共價鍵合于β-CD上,得到了具有ROS響應(yīng)性和H_2O_2清除能力的β-環(huán)糊精載體材料,即Ox-bCD。2.用改良的納米沉淀/自組裝法成功制備了空白納米粒和負(fù)載自由基清除劑Tpl的納米粒,其形態(tài)良好,粒徑分布均一,其具有ROS響應(yīng)性;且體外實驗證明Tpl-NPs能有效清除H_2O_2和超氧陰離子。3.口服或靜脈給藥后,Tpl-NPs能夠靶向于氧化應(yīng)激水平增高的組織損傷部位,靶向至損傷部位后,緩慢釋放Tpl,延長其在損傷部位的保留時間。通過消耗局部組織中的H_2O_2,并利用釋放的Tpl清除自由基,起到對胃腸損傷及肝臟損傷的保護(hù)與治療且副作用較低。4.ROS清除性納米粒對細(xì)胞的毒性較小,一次大劑量口服后對血常規(guī)、肝功能和腎功能無影響,對胃腸組織無刺激。靜脈注射對紅細(xì)胞無溶血現(xiàn)象。綜上所述,本課題通過構(gòu)建H_2O_2清除性的載體材料,以其負(fù)載自由基清除劑Tpl,合成了ROS清除性Tpl-NPs納米粒,該納米粒可靶向到組織損傷部位,延長自由基清除劑的體內(nèi)保留時間,有望成為一種新的抗NSAIDs和APAP副作用的納米藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R943

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本文編號：2297666