【摘要】：本文制備了可降解載基因微球(Microparticles，MPs)，利用MPs/pEGFP-ZNF580復合物轉染人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），達到了促進HUVECs增殖和遷移目的。針對高分子量聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)對細胞毒性高的問題，本文利用低分子量PEI制備了可降解型基因載體，并進行了評價。 1.為了克服高分子量PEI作為基因載體引起的細胞毒性問題，以聚乙二醇單甲醚(mPEG)、3(S)-甲基-嗎啉-2,5-二酮(MMD)、乙交酯(GA)和低分子量PEI為原料，制備了甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-嗎啉-2,5-二酮-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亞胺三嵌段共聚物(mPEG-b-P(MMD-co-GA)-g-PEI)，經自組裝形成“核-殼”結構MPs。其中，MPs的疏水“核”由P(MMD-co-GA)組成，以它作為交聯(lián)點，連接著眾多的PEI和PEG鏈段，從而形成具有親水性且?guī)д姾傻摹皻ぁ薄?MPs吸附并壓縮ZNF580基因，形成MPs/pEGFP-ZNF580復合物。與高分子量PEI相比，MPs和MPs/pEGFP-ZNF580復合物的細胞毒性大大降低。MPs/pEGFP-ZNF580復合物的轉染效果與LipofectamineTM2000的轉染效果相似，經轉染60小時后，HUVECs的增殖和遷移得到提高。本文提供了一種制備低毒性非病毒基因載體有效方法。 2.為了達到pEGFP-ZNF580從MPs/pEGFP-ZNF580復合物中持續(xù)釋放的目的，合成了具有不同降解速率的三嵌段共聚物，進而制備了具備不同降解速率疏水核心的MPs。首先，合成了甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-嗎啉-2,5-二酮)-接枝-聚乙烯亞胺(mPEG-b-PMMD-g-PEI)、甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-嗎啉-2,5-二酮-共聚-丙交酯)-接枝-聚乙烯亞胺(mPEG-b-P(MMD-co-LA)-g-PEI)和甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-嗎啉-2,5-二酮-共聚-丙交酯-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亞胺(mPEG-b-P(MMD-co-LA-co-GA)-g-PEI)三嵌段共聚物。之后，，經自組裝形成了MPs。 pEGFP-ZNF580能夠通過該復合物轉染進入HUVECs，western blot分析表明ZNF580關鍵蛋白表達水平升高至35.74%-46.11%，pEGFP-ZNF580能夠持續(xù)釋放25天。這種MPs/pEGFP-ZNF580復合物在實現(xiàn)組織工程支架和人工血管的快速內皮化方面，具有潛在的應用價值。 3.為了實現(xiàn)MPs對HUVECs的選擇性轉染，通過接枝Arg-Glu-Asp-Val(REDV)多肽，制備了靶向性三嵌段共聚物，即REDV-接枝-聚乙烯亞胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亞胺-接枝-REDV (REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV)和REDV-接枝-聚乙烯亞胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯-共聚-3(S)-甲基-嗎啉-2,5-二酮)-接枝-聚乙烯亞胺-接枝-REDV (REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV)。以此為基材制備了HUVECs靶向性MPs。 在HUVECs和人臍動脈平滑肌(HUASMCs)的共培養(yǎng)體系中，MPs/pEGFP-ZNF580復合物能夠特異性地選擇轉染HUVECs，促進內皮細胞增殖，并抑制HUASMCs增殖。結果表明，這種MPs/ZNF580復合物具有特異性內皮細胞選擇功能。
[Abstract]:Biodegradable gene carrying microspheres (Microparticles,MPs) were prepared and transfected into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs),) by MPs/pEGFP-ZNF580 complex to promote the proliferation and migration of HUVECs. Aiming at the high toxicity of high molecular weight polyethylene imine (Polyethyleneimine,PEI), a biodegradable gene vector with low molecular weight PEI was prepared and evaluated. In order to overcome the cytotoxicity caused by high molecular weight PEI as a gene vector, polyethylene glycol monomethyl ether (mPEG), 3 (S)-methyl-morpholine-2o-5-dione (MMD), glycolide (GA) and low molecular weight PEI) were used as raw materials. The mPEG-b-P (MMD-co-GA)-g-PEI triblock copolymers (mPEG-b-P (MMD-co-GA)-g-PEI) with methoxy-polyethylene glycol-block-poly (3 (S)-methyl-morpholine-2-diketone-5-diketone-ethylene lactide) were prepared. The MPs. with "core-shell" structure was formed by self-assembly. Among them, the hydrophobic "nucleus" of MPs is composed of P (MMD-co-GA), which acts as the crosslinking point and connects a large number of PEI and PEG segments to form a hydrophilic and positively charged "shell". MPs adsorbs and compresses ZNF580 gene to form MPs/pEGFP-ZNF580 complex. Compared with high molecular weight PEI, the cytotoxicity of MPs and MPs/pEGFP-ZNF580 complex was much lower. The transfection effect of MPs/pEGFP-ZNF580 complex was similar to that of LipofectamineTM2000. After 60 hours of transfection, the proliferation and migration of HUVECs were improved. This paper provides an effective method for preparation of low toxicity nonviral gene vector. 2. In order to continuously release pEGFP-ZNF580 from MPs/pEGFP-ZNF580 complexes, triblock copolymers with different degradation rates were synthesized, and MPs. with different degradation rate hydrophobic cores were prepared. First Methoxy-polyethylene glycol-block-poly (3 (S)-methyl-morpholine-2o-5-dione)-grafted polyimide (mPEG-b-PMMD-g-PEI), methoxy-polyethylene glycol-block-poly (3 (S)-methyl-morpholine-2o-5-diketone-copolymerization-lactide)-graft copolymerization-poly (ethylglycolide) were synthesized MPEG-b-P (MMD-co-LA)-g-PEI and mPEG-b-P (MMD-co-LA-co-GA)-g-PEI triblock copolymers of mPEG-b-P (MMD-co-LA)-g-PEI and methoxy-polyethylene glycol-block-poly (3 (S)-methyl-morpholine-2o-5-diketone-copolymerized-lactide-ethylene-lactide)-graft-polyethylene imide (mPEG-b-P (MMD-co-LA-co-GA)-g-PEI). After self-assembly, MPs. pEGFP-ZNF580 could be transfected into HUVECs,western blot by the complex. The expression level of ZNF580 key protein was increased to 35.74-46.11%, and pEGFP-ZNF580 could be released continuously for 25 days. This MPs/pEGFP-ZNF580 complex has potential application value in realizing rapid endothelialization of tissue engineering stents and artificial blood vessels. In order to realize the selective transfection of HUVECs by MPs, the targeted triblock copolymers were prepared by grafting Arg-Glu-Asp-Val (REDV) polypeptides. That is, REDV- grafted polyethyleneimine grafted poly (lactide copolymerizate-glycolide) grafted polyethyleneimide-grafted REDV (REDV-g-PEI-g-P (LA-co-GA) -g-PEI-g-REDV) and REDV- grafted polyvinyleneimide-grafted poly (lactide-co-ethyllactide 3 (S)- Methyl-morpholine-2o-5-diketone)-graft-polyimide-graft-REDV (REDV-g-PEI-g-P (LA-co-GA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV). HUVECs targeting MPs. was prepared by using this material as substrate. In the co-culture system of HUVECs and human umbilical artery smooth muscle (HUASMCs), MPs/pEGFP-ZNF580 complex can selectively transfect HUVECs, to promote endothelial cell proliferation and inhibit HUASMCs proliferation. The results showed that the MPs/ZNF580 complex had specific endothelial cell selection function.
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R943;O631.11

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本文編號：2269279