【摘要】：引起的疾病,以達到治療疾病的目的�；蛑委熞呀�(jīng)成為現(xiàn)代生命科學和醫(yī)學領(lǐng)域最有前景的研究方向之一。近些年發(fā)展的RNA干擾技術(shù)和基因組靶向編輯技術(shù),特別是最新的CRISPER/Cas9系統(tǒng)為基因治療提供了革命性技術(shù)手段,但是由于基因治療所要遞送的DNA、RNA或寡核苷酸等分子量過大且?guī)в写罅控撾姾?很難到達靶組織和細胞發(fā)揮作用,因此安全、有效的基因遞送載體成為了基因治療的關(guān)鍵。本論文的目的就是設計和合成安全、有效的多肽類基因遞送載體。目前臨床應用最廣泛、最高效的是病毒類載體,但是因為其毒性、免疫源性、致癌作用和難以大規(guī)模生產(chǎn)等問題難以克服,科學家們也一直通過設計非病毒載體來解決這些問題。近些年,多肽以其較好的生物相容性、功能多樣性和易于合成和修飾等特點成為一類很有發(fā)展前景的非病毒載體。在本論文中,我們針對非病毒載體基因遞送過程中面臨的障礙,如細胞透膜、內(nèi)涵體逃逸、進入細胞核、體內(nèi)抗酶降解和疾病組織靶向等問題,利用多肽功能的多樣性、易于合成和修飾的特點,尋找能夠克服基因遞送障礙的功能多肽分子,并將多肽分子這些特點有機地組合在一起,協(xié)同發(fā)揮作用,最終得到了一系列轉(zhuǎn)染效率高、生物安全性好的新型多功能片段組裝的多肽類基因載體。本文主體分為三部分:1、針對非病毒載體所面臨的基因的負載、細胞透膜、內(nèi)涵體逃逸、進入細胞核這幾個主要的細胞水平基因遞送障礙,進行多功能載體結(jié)構(gòu)設計多肽載體設計包括:透膜肽TAT介導復合物內(nèi)吞進入細胞;α-螺旋抗菌肽(LLKK)3片段破壞內(nèi)涵體將DNA納米復合物釋放到細胞質(zhì)最終進入細胞核;硬脂酸基團在分子內(nèi)部提供疏水環(huán)境可以提高該類多肽的α-螺旋度,使(LLKK)3片段中亮氨酸和賴氨酸分別分布于α-螺旋的兩側(cè),一側(cè)親水,有利于賴氨酸和質(zhì)粒DNA結(jié)合形成穩(wěn)定致密的納米復合物,另一側(cè)疏水,亮氨酸與脂質(zhì)雙層膜融合以提高細胞內(nèi)吞和內(nèi)涵體逃逸效率;半胱氨酸的巰基可以發(fā)生交聯(lián),起到穩(wěn)定多肽/DNA復合物的作用,避免DNA降解。通過系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)設計和功能評價,最終得到了兩個高活性、低毒性的多肽基因載體,轉(zhuǎn)染效率與商用脂質(zhì)體Lipofecatamie 2000相當。另外為了提高肽序列的透膜和體內(nèi)抗酶解能力,我們還設計了由D型氨基酸組成的多肽載體,其細胞和小動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染活性評價結(jié)果表明:細胞轉(zhuǎn)染效率進一步提高了數(shù)倍。在實驗中,我們用MALDI-TOF質(zhì)譜對多肽的分子量進行了確認,用圓二色譜儀對多肽的二級結(jié)構(gòu)進行了分析;利用瓊脂糖凝膠電泳、動態(tài)光散射、透射電子顯微鏡等方法,對多肽載體的DNA結(jié)合能力、多肽/DNA復合物的粒徑、zeta電位和表觀形貌進行了分析;用流式細胞儀、共聚焦顯微鏡等技術(shù),對多肽載體的DNA遞送能力、內(nèi)涵體逃逸效率、轉(zhuǎn)染效率和多肽介導DNA復合物進入細胞的機制等進行了研究;并對多肽以及多肽/DNA復合物的安全性分別進行了評價。我們還利用小動物活體成像技術(shù)對全D型氨基酸組成的C18-c(llkk)3c-tat(D型氨基酸多肽用小寫字母表示)動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率進行了評價,結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)染效率與陽性對照Lipofecatamie 2000相當。2、引入組氨酸,進一步增強內(nèi)涵體逃逸能力的載體結(jié)構(gòu)設計內(nèi)涵體吞噬是基因遞送過程的一個關(guān)鍵障礙,組氨酸能夠在酸性的內(nèi)涵體中不斷吸收質(zhì)子,通過“質(zhì)子海綿”效應漲破內(nèi)涵體,基因/載體復合物得以釋放至細胞質(zhì)。在上述肽序列的基礎(chǔ)上,我們通過組氨酸替換賴氨酸或加入組氨酸肽片段的方式設計了四個新的多肽載體,通過將組氨酸的質(zhì)子海綿作用與α螺旋抗菌肽的打孔作用結(jié)合,以期達到更高的轉(zhuǎn)染效率。在實驗中,我們測試了4個載體的DNA結(jié)合能力,多肽/DNA復合物的粒徑和在NIH-3T3中的轉(zhuǎn)染活性,結(jié)果顯示:這四個載體均能很好地結(jié)合DNA,并形成粒徑較小、形狀規(guī)則的納米顆粒,轉(zhuǎn)染效率大大提高。其中最高的C18-C(LLHH)3C-TAT比上一章中活性最高的全D型載體C_(18)-c(llkk)_3c-tat提高了7.8倍,比陽性對照Lipofectamine 2000和PEI 25k Da分別高出21.9倍和17.2倍。由此可見,將組氨酸序列與α螺旋肽適當組合,使前者質(zhì)子海綿作用與后者的細胞打孔作用疊加,可有效提高DNA轉(zhuǎn)染效率,是一種科學、可行的基因遞送載體設計新策略。3、針對轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細胞,透過血腦屏障的載體結(jié)構(gòu)設計以陽離子透膜肽為主的基因遞送載體的問題之一是缺乏細胞靶向能力,在全身給藥時很難達到理想的治療效果,特別是腦內(nèi)疾病。細胞表面有諸多生物大分子,行使與各自配體特異性相互作用的功能。RVG(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)是來源于狂犬病毒糖蛋白的一個29肽,能夠與神經(jīng)元細胞表達的乙酰膽堿受體特異性結(jié)合,對神經(jīng)系統(tǒng)具有很好的靶向能力。本文中,我們利用自然連接反應將RVG29肽與上述設計1、2中的基因載體偶聯(lián),靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞,嘗試設計一種高效、安全轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細胞的載體。實驗結(jié)果顯示,我們合成的RVG-c(llkk)3-tat和RVG-c(llhh)3-tat兩個載體仍能很好結(jié)合DNA,形成較小粒徑的納米顆粒,對大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞(C6)的轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染效率明顯高于脂質(zhì)體Lipofectamine 2000。加入RVG靶向序列與c(llkk)3-tat相比,轉(zhuǎn)染效率大大提高,可見RVG在轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞C6細胞時對提高轉(zhuǎn)染效率發(fā)揮了重要作用。除了本文正文中重點介紹了三類21個多肽基因載體以外,文中還按照以上的多肽組裝策略還合成了34個多功能片段組裝的多肽類基因載體,并對其理化性質(zhì)、結(jié)合DNA的能力、基因遞送和轉(zhuǎn)染效率進行了評價,由于篇幅所限未在正文中詳述。具體如下(附錄1、2):1、天然產(chǎn)物樺木酸(Betulinic acid,BA)和齊墩果酸(Oleanolic acid,OA)作為疏水性基團替換硬脂酸得到2個基因載體,BA-g(llkk)3g-tat和OA-g(llkk)3g-tat,其轉(zhuǎn)染效率與C18-C(LLKK)3C-TAT相當。據(jù)報道樺木酸具有抗腫瘤和抗炎活性,在以后的實驗中將聯(lián)合基因治療對其抗腫瘤效果進行評價。2、在透膜肽N端修飾兩個棕櫚酸(Palmitic acid,PA)得到PA-K(PA)R9TAT,試圖利用疏水作用提高透膜肽的基因轉(zhuǎn)染效率,但實驗中發(fā)現(xiàn)其內(nèi)涵體逃逸能力較弱,未能達到理想的轉(zhuǎn)染效果。3、利用HIV-1 gp41蛋白中的融合肽(FP23、HGP、s HGP和PVI等)作為內(nèi)涵體逃逸功能片段,合成了FP23KR9K-PVI、FP23KR9K-CH6、FP23KR9K-s HGP、FP23KR9K-SV40、Chol-KR9K-s HGP、Chol-KR9K-PVI等多肽載體,但由于其透膜能力較差,造成轉(zhuǎn)染效率較低。4、利用抗菌肽(LLRR)3和pexiganan(pexi)與透膜肽、硬脂酸等進行組合,得到基因載體(LLRR)3和C18-Pex-TAT等,但此類毒性較大,只做了主要指標評價。本文的創(chuàng)新在于:1、利用多肽化合物的結(jié)構(gòu)、功能多樣性,選取病毒或細菌的蛋白中對基因遞送發(fā)揮重要作用的功能多肽,或是根據(jù)這些天然多肽的序列和結(jié)構(gòu)特點人工設計多肽,并通過化學合成方法將各功能多肽進行合成和組裝;2、研究不同功能多肽的結(jié)構(gòu)特征和組裝規(guī)律對基因遞送的作用,合理地將不同功能的多肽進行組合,使各功能肽段能夠協(xié)同發(fā)揮作用,有針對性的解決基因遞送重重障礙;3、通過研究多功能肽類載體與核酸藥物的組裝規(guī)律,來設計多肽基因載體的結(jié)構(gòu),實現(xiàn)更高的轉(zhuǎn)染效率。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R91

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 毛建平;;基因治療20年[J];中國生物工程雜志;2010年09期

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本文編號：2267379