【摘要】：天然化學(xué)連接法(NCL)廣泛應(yīng)用于各種蛋白或多肽的合成,其反應(yīng)機(jī)理為C-端硫酯和N-端半胱氨酸殘基發(fā)生分子間硫酯交換,然后經(jīng)過(guò)分子內(nèi)的酰基轉(zhuǎn)移,得到產(chǎn)物。天然化學(xué)連接法最主要的局限性在于,反應(yīng)底物中必需要有半胱氨酸殘基,而半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)中的含量又非常的少,平均含量?jī)H為1.3%。因此,能否利用C-端硫酯直接和沒(méi)有半胱氨酸殘基的N-端氨基在生物反應(yīng)體系、較溫和條件下反應(yīng)來(lái)合成多肽或蛋白成為化學(xué)合成研究的熱點(diǎn),也是生物化學(xué)家們關(guān)注的焦點(diǎn)。 本研究以課題組的前期研究工作為基礎(chǔ),利用HMDO作為助劑,以環(huán)境友好的離子液體作為溶劑,完成新反應(yīng)條件的篩選。我們首先以N-Cbz-L苯丙氨酸硫酯和L-苯丙氨酸乙酯反應(yīng)為模板,找到最佳的反應(yīng)條件,具體反應(yīng)條件為：N-Cbz-L苯丙氨酸對(duì)甲苯硫酯用量為1當(dāng)量,HMDO用量為1當(dāng)量,L-苯丙氨酸用量為2當(dāng)量,[BMIM]PF6為2mL,反應(yīng)溫度為40℃,反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí),柱分離收率為93%。然后,我們研究了反應(yīng)底物適應(yīng)性,合成了一系列的二肽、三肽和四肽,結(jié)果表明,反應(yīng)體系具有高度官能團(tuán)相容性,反應(yīng)體系中有羥基、羧基存在時(shí),反應(yīng)仍能很好進(jìn)行。最后,通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng),發(fā)現(xiàn)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物沒(méi)有發(fā)生消旋。我們也用此方法成功對(duì)一些小分子化合物和溶菌酶進(jìn)行了修飾。高分辨質(zhì)譜結(jié)果表明,溶菌酶在24小時(shí)后已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。此外,我們也對(duì)氧酯與氨基反應(yīng)合成多肽進(jìn)行了初步探索,結(jié)果表明,在反應(yīng)體系中加入0.1當(dāng)量對(duì)甲苯硫酚,可以加快反應(yīng)進(jìn)程并提高反應(yīng)收率,高分辨質(zhì)譜結(jié)果也驗(yàn)證了反應(yīng)過(guò)程經(jīng)歷了氧酯和硫酯之間的酯交換。 自上世紀(jì)六十年代以來(lái),蒽環(huán)類抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)就成為臨床上用量最大的化學(xué)治療藥物之一,廣泛用于治療各種癌癥,但是,長(zhǎng)期使用阿霉素會(huì)出現(xiàn)多藥耐藥性,劑量累積性的心肌癥和充血性心力衰竭也成為制約阿霉素臨床用量的主要原因之一。 本課題對(duì)前期DOX-EBP的合成路線進(jìn)行了改進(jìn),用新開(kāi)發(fā)的HMDO促進(jìn)多肽合成方法,取代原合成路線中BOP催化的酰胺鍵合成方法,避免生成具有致癌性的六甲基磷酰三胺(HMPA),同時(shí),也對(duì)DOX-EBP是否能夠克服耐藥性進(jìn)行了研究。 首先,我們從SW480細(xì)胞衍生得到耐藥性的SW480/DOX細(xì)胞,并證明SW480/DOX細(xì)胞確實(shí)對(duì)游離阿霉素具有耐藥性。然后,通過(guò)western blot分析發(fā)現(xiàn),SW480/DOX細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的原因是由于P-gp的過(guò)量表達(dá)。接下來(lái),我們以阿霉素為對(duì)照藥物,SW480細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞,研究DOX-EBP對(duì)SW480/DOX細(xì)胞的細(xì)胞毒性和DOX-EBP克服細(xì)胞耐藥性的機(jī)制,結(jié)果表明,在兩種細(xì)胞的膜囊泡內(nèi)都沒(méi)有檢測(cè)到釩酸鹽敏感的ATPase活性, DOX-EBP與P-gp沒(méi)有相互作用,所以,DOX-EBP可以克服細(xì)胞的耐藥性。 最后,我們用抗表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體C225阻斷DOX-EBP與表皮生長(zhǎng)因子受體的相互作用,內(nèi)吞抑制劑PAO阻斷表皮生長(zhǎng)因子受體的內(nèi)吞作用,來(lái)研究DOX-EBP進(jìn)入細(xì)胞的途徑,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DOX-EBP首先與表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合,然后通過(guò)通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,在溶酶體中分解,釋放出游離阿霉素,發(fā)揮作用。 綜上所述,我們已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)出HMDO促進(jìn)的多肽合成方法,并將此方法應(yīng)用于阿霉素(DOX)和表皮生長(zhǎng)因子片段EBP的偶聯(lián)物DOX-EBP的合成中,從而避免使用能生成致癌物HMPA的BOP。同時(shí),機(jī)制研究表明,DOX-EBP可以克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性問(wèn)題。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R914.3

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本文編號(hào)：2259770