【摘要】：天然化學連接法(NCL)廣泛應用于各種蛋白或多肽的合成,其反應機理為C-端硫酯和N-端半胱氨酸殘基發(fā)生分子間硫酯交換,然后經(jīng)過分子內(nèi)的酰基轉(zhuǎn)移,得到產(chǎn)物。天然化學連接法最主要的局限性在于,反應底物中必需要有半胱氨酸殘基,而半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)中的含量又非常的少,平均含量僅為1.3%。因此,能否利用C-端硫酯直接和沒有半胱氨酸殘基的N-端氨基在生物反應體系、較溫和條件下反應來合成多肽或蛋白成為化學合成研究的熱點,也是生物化學家們關(guān)注的焦點。 本研究以課題組的前期研究工作為基礎(chǔ),利用HMDO作為助劑,以環(huán)境友好的離子液體作為溶劑,完成新反應條件的篩選。我們首先以N-Cbz-L苯丙氨酸硫酯和L-苯丙氨酸乙酯反應為模板,找到最佳的反應條件,具體反應條件為：N-Cbz-L苯丙氨酸對甲苯硫酯用量為1當量,HMDO用量為1當量,L-苯丙氨酸用量為2當量,[BMIM]PF6為2mL,反應溫度為40℃,反應時間為48小時,柱分離收率為93%。然后,我們研究了反應底物適應性,合成了一系列的二肽、三肽和四肽,結(jié)果表明,反應體系具有高度官能團相容性,反應體系中有羥基、羧基存在時,反應仍能很好進行。最后,通過HPLC監(jiān)測反應,發(fā)現(xiàn)反應過程中產(chǎn)物沒有發(fā)生消旋。我們也用此方法成功對一些小分子化合物和溶菌酶進行了修飾。高分辨質(zhì)譜結(jié)果表明,溶菌酶在24小時后已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。此外,我們也對氧酯與氨基反應合成多肽進行了初步探索,結(jié)果表明,在反應體系中加入0.1當量對甲苯硫酚,可以加快反應進程并提高反應收率,高分辨質(zhì)譜結(jié)果也驗證了反應過程經(jīng)歷了氧酯和硫酯之間的酯交換。 自上世紀六十年代以來,蒽環(huán)類抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)就成為臨床上用量最大的化學治療藥物之一,廣泛用于治療各種癌癥,但是,長期使用阿霉素會出現(xiàn)多藥耐藥性,劑量累積性的心肌癥和充血性心力衰竭也成為制約阿霉素臨床用量的主要原因之一。 本課題對前期DOX-EBP的合成路線進行了改進,用新開發(fā)的HMDO促進多肽合成方法,取代原合成路線中BOP催化的酰胺鍵合成方法,避免生成具有致癌性的六甲基磷酰三胺(HMPA),同時,也對DOX-EBP是否能夠克服耐藥性進行了研究。 首先,我們從SW480細胞衍生得到耐藥性的SW480/DOX細胞,并證明SW480/DOX細胞確實對游離阿霉素具有耐藥性。然后,通過western blot分析發(fā)現(xiàn),SW480/DOX細胞產(chǎn)生耐藥性的原因是由于P-gp的過量表達。接下來,我們以阿霉素為對照藥物,SW480細胞為對照細胞,研究DOX-EBP對SW480/DOX細胞的細胞毒性和DOX-EBP克服細胞耐藥性的機制,結(jié)果表明,在兩種細胞的膜囊泡內(nèi)都沒有檢測到釩酸鹽敏感的ATPase活性, DOX-EBP與P-gp沒有相互作用,所以,DOX-EBP可以克服細胞的耐藥性。 最后,我們用抗表皮生長因子受體單克隆抗體C225阻斷DOX-EBP與表皮生長因子受體的相互作用,內(nèi)吞抑制劑PAO阻斷表皮生長因子受體的內(nèi)吞作用,來研究DOX-EBP進入細胞的途徑,實驗結(jié)果表明,DOX-EBP首先與表皮生長因子受體結(jié)合,然后通過通過表皮生長因子介導的內(nèi)吞作用進入細胞,在溶酶體中分解,釋放出游離阿霉素,發(fā)揮作用。 綜上所述,我們已經(jīng)成功開發(fā)出HMDO促進的多肽合成方法,并將此方法應用于阿霉素(DOX)和表皮生長因子片段EBP的偶聯(lián)物DOX-EBP的合成中,從而避免使用能生成致癌物HMPA的BOP。同時,機制研究表明,DOX-EBP可以克服腫瘤細胞的耐藥性問題。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R914.3

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本文編號：2259770