【摘要】：研究背景蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化修飾是真核細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的一種重要調(diào)控,動態(tài)可逆的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化程度由蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTK)和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)協(xié)同調(diào)控。PTP在許多生理過程中發(fā)揮關鍵作用,調(diào)控細胞的增殖分化、遷移、細胞內(nèi)代謝、免疫應答和神經(jīng)活動等。異常的PTP活力可能引發(fā)多種人類疾病,如癌癥或者糖尿病。PTP1B在胰島素信號通路中起負調(diào)控作用,其活性異常與糖尿病發(fā)生有關。YopH是耶爾森菌逃避宿主先天免疫應答的重要因子;紋狀體富集蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(Striatal enriched tyrosine phosphatases,STEP)作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的磷酸酶,對突觸的可塑性、神經(jīng)元的生存等具有重要調(diào)節(jié)作用。STEP功能失調(diào)有可能導致包括阿爾茲海默癥在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性性疾病。目前,PTP作為潛在的藥物靶標日益引起關注。特異性調(diào)控PTP的小分子化合物不僅是應用于開發(fā)臨床藥物的希望所在,也可作為特定的活性探針來研究并闡明PTP在細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮的重要作用。因此發(fā)展高效的小分子探針并深入研究其作用機制具有重要意義。研究目的通過獲得純化的STEP、LYP、PTP1B、YopH和MEG2蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶進行酶學分析及小分子抑制劑活性篩選的研究。材料與方法將STEP、LYP、PTP1B、YopH和MEG2蛋白磷酸酶野生型序列亞克隆到pET-15b、pET-28a和pET-22b等表達載體上,隨后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21工程菌中表達,通過親和層析和凝膠阻滯層析等技術,獲得純化的STEP、LYP等磷酸酶,并以pNPP為底物對其進行體外酶活測定,并運用連續(xù)讀數(shù)法、IC50半抑制效率測定法、抑制劑酶動力學測定進行抑制劑篩選,隨后通過測定抑制劑對其他磷酸酶PPM家族的選擇性揭示化合物是否具.有特異性,確定化合物的作用。結(jié)果實驗結(jié)果表明STEP、YopH、MEG2等磷酸酶蛋白表達成功,并可經(jīng)純化活動純度超過90%的酶用于體外酶學實驗。純化后的STEP、YopH、MEG2等磷酸酶SDS-PAGE電泳表觀分子量分別為35kDa、33kDa、38kDa等。隨后,根據(jù)對STEP等磷酸酶基本酶活分析,又從化合物庫中篩選出1種具明顯抑制作用且結(jié)構(gòu)新穎的抑制劑,小分子化合物E4以時間和濃度依賴性的方式抑制了 STEP蛋白活性。進一步研究表明,化合物E4以時間依賴性方式抑制一系列PTP,而其較少抑制或沒有抑制金屬依賴性蛋白磷酸酶。結(jié)論在這里,我們將化合物E4表征為一類新的PTP活性探針。通過活性依賴方式共價標記在PTP的活性位點的化學探針可以極大的促進對PTP功能研究。總的來說,這種新鑒定的PTP的共價抑制劑可以被用來作為PTP活性位點Cys的定向探針來研究PTP在細胞信號傳導中的作用。
[Abstract]:Background protein tyrosine phosphorylation modification is an important regulation of signal transduction in eukaryotic cells. The dynamic and reversible protein tyrosine phosphorylation is coordinated by protein tyrosine kinase (PTK) and protein tyrosine phosphatase (PTP), which plays a key role in many physiological processes and regulates cell proliferation, differentiation, migration and intracellular metabolism. Immune response and neural activity, etc. Abnormal PTP activity may lead to a variety of human diseases, such as cancer or diabetes. PTP1B plays a negative role in insulin signaling pathway. The abnormal activity of PTP is related to the occurrence of diabetes. YopH is an important factor that Yersinia evades the host innate immune response. Striatum enriched protein tyrosine phosphatase (Striatal enriched tyrosine phosphatases,STEP) as a central nervous system specific phosphatase, synaptic plasticity, Neuron survival and other important regulatory effects. Step dysfunction may lead to a variety of neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease. At present, PTP as a potential drug target has attracted more and more attention. Small molecular compounds that specifically regulate PTP are not only promising for the development of clinical drugs, but also serve as specific active probes to study and elucidate the important role of PTP in intracellular signal transduction. Therefore, it is of great significance to develop high efficient small molecular probes and to study the mechanism of their action. Objective to study the enzymatic analysis of purified STEP,LYP,PTP1B,YopH and MEG2 protein tyrosine phosphatase and the screening of small molecule inhibitor activity. Materials and methods STEP,LYP,PTP1B,YopH and MEG2 protein phosphatase wild-type sequences were subcloned into pET-15b,pET-28a and pET-22b expression vectors, and then transformed into E.coli BL21 engineering bacteria for expression. Purified STEP,LYP and other phosphatase were obtained by affinity chromatography and gel block chromatography. The enzyme activity in vitro was determined by using pNPP as substrate, and the IC50 semi-inhibition efficiency was determined by continuous reading method, and the inhibitor was screened by enzyme kinetic assay. The selectivity of inhibitors to other phosphatase PPM families was then determined. Have specificity, determine the action of compound. Results the results showed that STEP,YopH,MEG2 and other phosphatase proteins were successfully expressed and could be used in enzymatic experiments in vitro after purified enzyme with activity purity of more than 90%. The apparent molecular weight of purified STEP,YopH,MEG2 isophosphatase SDS-PAGE was 35kDaA33kDa / 38kDa, respectively. Then, according to the analysis of the activity of phosphatase such as STEP, a novel inhibitor with obvious inhibitory effect was selected from the compound library. The activity of STEP protein was inhibited by small molecular compound E4 in a time-and concentration-dependent manner. Further studies have shown that compound E4 inhibits a series of PTP, in a time-dependent manner, but it has little or no inhibition of metalloprotein phosphatase. Conclusion compounds E4 are characterized as a new PTP active probe. The study of the function of PTP can be greatly promoted by covalently labeling the chemical probes at the active sites of PTP in an activity-dependent manner. In general, this newly identified covalent inhibitor of PTP can be used as a directional probe for Cys, the active site of PTP, to study the role of PTP in cell signal transduction.
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R915

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 ;中國科大等實現(xiàn)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的定性和定量檢測[J];生命的化學;2013年02期

2 張梅,余清聲;中華眼鏡蛇毒F組份對血小板活化時蛋白酪氨酸磷酸化的影響[J];中國病理生理雜志;2005年02期

3 李勇,裴林,張光毅;腦缺血/再灌對蒙古沙土鼠海馬突觸體酪氨酸磷酸化的影響[J];生理學報;2000年02期

4 魯仲云;;酪氨酸磷酸化作用參與人類免疫缺陷病毒1型的細胞病變效應[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1993年01期

5 孫文均,余應年,付一提,魯?shù)聫?姜槐;工頻磁場對細胞蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化影響的研究[J];中國病理生理雜志;1999年08期

6 劉永,高燦,張光毅;腦缺血再灌注對海馬NMDA受體2A亞基酪氨酸磷酸化的影響[J];徐州醫(yī)學院學報;2000年04期

7 王連榮,王菊光,吳偉康;黏著斑激酶酪氨酸磷酸化在牽拉依賴的細胞形態(tài)改變中的作用[J];中山醫(yī)科大學學報;2002年04期

8 黃巧冰，，趙克森，劉杰;血管內(nèi)皮細胞蛋白酪氨酸磷酸化在血管通透性調(diào)節(jié)中的作用[J];中國危重病急救醫(yī)學;1999年08期

9 余果宇;紅細胞膜帶3蛋白酪氨酸磷酸化的研究進展[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;2004年02期

10 陳沙力,孟慶勇,劉樹錚;輻射誘導小鼠免疫細胞蛋白質(zhì)表達變化及酪氨酸磷酸化[J];白求恩醫(yī)科大學學報;1998年02期

相關會議論文 前5條

1 葛伊莉;彭紅;張功臣;黃開勛;;病理條件下胰島素信號系統(tǒng)中蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的研究[A];湖北省化學化工學會2006年年會暨循環(huán)經(jīng)濟專家論壇論文集[C];2006年

2 劉長鎖;陳乃宏;;蛋白酪氨酸磷酸化在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)分泌中的作用[A];中國神經(jīng)科學學會第六屆學術會議暨學會成立十周年慶祝大會論文摘要匯編[C];2005年

3 王實;單世梁;金一;;冷凍處理對豬精子蛋白酪氨酸磷酸化水平的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會第十五屆學術研討會論文集（下冊）[C];2010年

4 黃定德;陳杞;韓玲;蔡建明;傅志超;李百龍;黃越承;林亞華;;γ射線誘發(fā)的小鼠胸腺淋巴瘤細胞蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化[A];第九次全國生物物理大會學術會議論文摘要集[C];2002年

5 鄧晶;勞偉峰;黃學鋒;;RON變異體RON△170對自身酪氨酸磷酸化變異體RON△160的顯性抑制作用[A];2009年浙江省腫瘤外科學術年會暨腫瘤外科規(guī)范化診治學習班論文匯編[C];2009年

相關博士學位論文 前4條

1 王一國;酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學及重要信號分子的調(diào)節(jié)通路與生物學功能分析研究[D];中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）;2007年

2 滕春波;信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3在小鼠子宮及黃體中的表達與調(diào)節(jié)[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2003年

3 周榮;BK_（Ca）通道α亞基酪氨酸磷酸化在休克VHR中的作用及其調(diào)控[D];第三軍醫(yī)大學;2004年

4 張雷;Dmrt1信號調(diào)控以及功能分析[D];武漢大學;2010年

相關碩士學位論文 前7條

1 葛琳;蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶家族不可逆苯并咪唑噻唑衍生物抑制劑的發(fā)現(xiàn)[D];山東大學;2017年

2 董欽才;c-Ab1非受體酪氨酸激酶介導的FoxM1磷酸化及其功能研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2014年

3 孔麗娟;豚鼠精子體外獲能過程中蛋白酪氨酸磷酸化的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2007年

4 曲洪美;胰島素受體、胰島素受體底物-1表達及其酪氨酸磷酸化與妊娠期糖尿病胰島素抵抗的關系[D];青島大學;2007年

5 劉穎;高尿酸對3T3-L1脂肪細胞IRS-1表達及其酪氨酸磷酸化水平的影響[D];中南大學;2013年

6 李勃興;BK_（Ca）通道的功能活動可調(diào)控細胞蛋白酪氨酸磷酸化水平[D];第一軍醫(yī)大學;2006年

7 鄧晶;RON變異體RON△170對自身酷氨酸磷酸化變異體RON△160的顯性抑制作用[D];浙江大學;2010年

本文編號：2237283