【摘要】：研究背景蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化修飾是真核細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種重要調(diào)控,動態(tài)可逆的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化程度由蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTK)和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)協(xié)同調(diào)控。PTP在許多生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,調(diào)控細(xì)胞的增殖分化、遷移、細(xì)胞內(nèi)代謝、免疫應(yīng)答和神經(jīng)活動等。異常的PTP活力可能引發(fā)多種人類疾病,如癌癥或者糖尿病。PTP1B在胰島素信號通路中起負(fù)調(diào)控作用,其活性異常與糖尿病發(fā)生有關(guān)。YopH是耶爾森菌逃避宿主先天免疫應(yīng)答的重要因子;紋狀體富集蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(Striatal enriched tyrosine phosphatases,STEP)作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的磷酸酶,對突觸的可塑性、神經(jīng)元的生存等具有重要調(diào)節(jié)作用。STEP功能失調(diào)有可能導(dǎo)致包括阿爾茲海默癥在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性性疾病。目前,PTP作為潛在的藥物靶標(biāo)日益引起關(guān)注。特異性調(diào)控PTP的小分子化合物不僅是應(yīng)用于開發(fā)臨床藥物的希望所在,也可作為特定的活性探針來研究并闡明PTP在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮的重要作用。因此發(fā)展高效的小分子探針并深入研究其作用機(jī)制具有重要意義。研究目的通過獲得純化的STEP、LYP、PTP1B、YopH和MEG2蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶進(jìn)行酶學(xué)分析及小分子抑制劑活性篩選的研究。材料與方法將STEP、LYP、PTP1B、YopH和MEG2蛋白磷酸酶野生型序列亞克隆到pET-15b、pET-28a和pET-22b等表達(dá)載體上,隨后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21工程菌中表達(dá),通過親和層析和凝膠阻滯層析等技術(shù),獲得純化的STEP、LYP等磷酸酶,并以pNPP為底物對其進(jìn)行體外酶活測定,并運(yùn)用連續(xù)讀數(shù)法、IC50半抑制效率測定法、抑制劑酶動力學(xué)測定進(jìn)行抑制劑篩選,隨后通過測定抑制劑對其他磷酸酶PPM家族的選擇性揭示化合物是否具.有特異性,確定化合物的作用。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明STEP、YopH、MEG2等磷酸酶蛋白表達(dá)成功,并可經(jīng)純化活動純度超過90%的酶用于體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)。純化后的STEP、YopH、MEG2等磷酸酶SDS-PAGE電泳表觀分子量分別為35kDa、33kDa、38kDa等。隨后,根據(jù)對STEP等磷酸酶基本酶活分析,又從化合物庫中篩選出1種具明顯抑制作用且結(jié)構(gòu)新穎的抑制劑,小分子化合物E4以時間和濃度依賴性的方式抑制了 STEP蛋白活性。進(jìn)一步研究表明,化合物E4以時間依賴性方式抑制一系列PTP,而其較少抑制或沒有抑制金屬依賴性蛋白磷酸酶。結(jié)論在這里,我們將化合物E4表征為一類新的PTP活性探針。通過活性依賴方式共價標(biāo)記在PTP的活性位點(diǎn)的化學(xué)探針可以極大的促進(jìn)對PTP功能研究�？偟膩碚f,這種新鑒定的PTP的共價抑制劑可以被用來作為PTP活性位點(diǎn)Cys的定向探針來研究PTP在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中的作用。
[Abstract]:Background protein tyrosine phosphorylation modification is an important regulation of signal transduction in eukaryotic cells. The dynamic and reversible protein tyrosine phosphorylation is coordinated by protein tyrosine kinase (PTK) and protein tyrosine phosphatase (PTP), which plays a key role in many physiological processes and regulates cell proliferation, differentiation, migration and intracellular metabolism. Immune response and neural activity, etc. Abnormal PTP activity may lead to a variety of human diseases, such as cancer or diabetes. PTP1B plays a negative role in insulin signaling pathway. The abnormal activity of PTP is related to the occurrence of diabetes. YopH is an important factor that Yersinia evades the host innate immune response. Striatum enriched protein tyrosine phosphatase (Striatal enriched tyrosine phosphatases,STEP) as a central nervous system specific phosphatase, synaptic plasticity, Neuron survival and other important regulatory effects. Step dysfunction may lead to a variety of neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease. At present, PTP as a potential drug target has attracted more and more attention. Small molecular compounds that specifically regulate PTP are not only promising for the development of clinical drugs, but also serve as specific active probes to study and elucidate the important role of PTP in intracellular signal transduction. Therefore, it is of great significance to develop high efficient small molecular probes and to study the mechanism of their action. Objective to study the enzymatic analysis of purified STEP,LYP,PTP1B,YopH and MEG2 protein tyrosine phosphatase and the screening of small molecule inhibitor activity. Materials and methods STEP,LYP,PTP1B,YopH and MEG2 protein phosphatase wild-type sequences were subcloned into pET-15b,pET-28a and pET-22b expression vectors, and then transformed into E.coli BL21 engineering bacteria for expression. Purified STEP,LYP and other phosphatase were obtained by affinity chromatography and gel block chromatography. The enzyme activity in vitro was determined by using pNPP as substrate, and the IC50 semi-inhibition efficiency was determined by continuous reading method, and the inhibitor was screened by enzyme kinetic assay. The selectivity of inhibitors to other phosphatase PPM families was then determined. Have specificity, determine the action of compound. Results the results showed that STEP,YopH,MEG2 and other phosphatase proteins were successfully expressed and could be used in enzymatic experiments in vitro after purified enzyme with activity purity of more than 90%. The apparent molecular weight of purified STEP,YopH,MEG2 isophosphatase SDS-PAGE was 35kDaA33kDa / 38kDa, respectively. Then, according to the analysis of the activity of phosphatase such as STEP, a novel inhibitor with obvious inhibitory effect was selected from the compound library. The activity of STEP protein was inhibited by small molecular compound E4 in a time-and concentration-dependent manner. Further studies have shown that compound E4 inhibits a series of PTP, in a time-dependent manner, but it has little or no inhibition of metalloprotein phosphatase. Conclusion compounds E4 are characterized as a new PTP active probe. The study of the function of PTP can be greatly promoted by covalently labeling the chemical probes at the active sites of PTP in an activity-dependent manner. In general, this newly identified covalent inhibitor of PTP can be used as a directional probe for Cys, the active site of PTP, to study the role of PTP in cell signal transduction.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R915

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本文編號：2237283