【摘要】：微囊藻毒素(MCs)是一類由淡水藍藻產生的環(huán)狀七肽天然毒素,具有強烈的肝、腎毒性。本實驗室在前期研究中,率先發(fā)現(xiàn)MC-LR染毒后可顯著下調雄性小鼠睪酮水平并引發(fā)生精功能障礙。生精功能障礙嚴重影響人類的生活健康,而睪酮分泌不足可導致男性生殖異常、心血管疾病、糖尿病及骨質疏松癥等多種病癥。因此,探討MC-LR對雄性生殖系統(tǒng)的損傷,特別是引起睪酮水平顯著下調的機制,對評定MC-LR的雄性健康風險具有重要的意義。本實驗研究了 MC-LR急性染毒后對雄性小鼠睪丸細胞致凋亡作用的機制;評估了 MC-LR對下丘腦-垂體-睪丸軸激素調節(jié)系統(tǒng)的影響,確認了 MC-LR在下丘腦-垂體-睪丸軸激素調節(jié)系統(tǒng)的靶位點;進一步探討了 MC-LR對靶細胞-GnRH神經元產生細胞毒性及影響其功能的分子機制。全文共分為三個部分:第一部分MC-LR急性染毒誘導雄性小鼠睪丸細胞凋亡機制探討一、目的檢測MC-LR急性染毒對雄性小鼠睪丸組織結構細胞凋亡的影響,并探討MC-LR誘導雄性小鼠睪丸細胞凋亡的機制;建立MC-LR染毒大鼠睪丸間質細胞(Leydigcells)模型,研究MC-LR對間質細胞的影響。二、方法1、Balb/c 雄性成年小鼠腹腔注射 MC-LR(0,3.75,7.5,15,30μg/kg.b.w),連續(xù)注射1天,4天后,頸椎脫臼處死小鼠。組織切片觀察睪丸組織損傷情況,TUNEL染色檢測睪丸組織細胞凋亡情況。2、通過 RT-PCR,檢測pp2A,p53,Bcl-2,Bax,Cyt-c,c-jun,c-fos,c-myc,Caspase 3,Caspase 8 表達水平。3、通過 Western Blot,檢測 PP2A/p-PP2A,p53/p-p53,Bcl-2/p-Bcl-2,Bax,Cyt-c,Caspase 3水平變化。4、MC-LR(0,1,10,100,250,500,750,1000 nM)染毒大鼠間質細胞 48 h后,取2小時內的細胞培養(yǎng)液檢測睪酮濃度,CCK-8法檢測細胞活力,FDA-PI雙染檢測細胞活率,免疫熒光示蹤MC-LR檢測MC-LR是否進入間質細胞。三、結果1、MC-LR染毒1天后,15和30μg/kg.b.w注射組,睪丸組織出現(xiàn)輕微的結構松散,細胞脫落的狀況;MC-LR連續(xù)染毒4天后,7.5,15和30μg/kg.b.w注射組,睪丸組織均出現(xiàn)結構松散,細胞脫落的狀況;30μg/kg.b.w注射組,曲細精管內可觀察到明顯的精子數(shù)量減少。2、TUNEL檢測睪丸組織切片凋亡狀況,結果表明,隨著染毒劑量的加大和染毒時間的增加,睪丸組織細胞凋亡的比例顯著上升。提示MC-LR誘發(fā)睪丸細胞凋亡具有時間-劑量依賴性特點。3、RT-PCR結果表明,MC-LR可顯著上調凋亡相關分子Bax、caspase3,caspase 5表達水平,增殖相關因子c-myc,c-jun,c-fos表達水平。Western Blot結果表明,MC-LR顯著上調p-p53及p-Bcl-2水平。MC-LR對睪丸組織Bcl-2的表達水平沒有顯著影響。1、MC-LR染毒間質細胞后,細胞培養(yǎng)液中睪酮濃度沒有顯著變化,細胞活力及活率均沒有顯著變化;免疫熒光示蹤結果表明,MC-LR沒有進入間質細胞內部。四、結論1、MC-LR進入睪丸組織后,可誘發(fā)睪丸細胞凋亡,結構損傷,繼而導致功能障礙。且MC-LR進入組織后,通過與底物PP2A結合,上調磷酸化p53及磷酸化Bcl-2 水平,經由Bax-Caspase通路引發(fā)細胞凋亡。2、MC-LR對睪酮合成細胞-間質細胞無細胞毒性,不改變其合成睪酮的能力。第二部分MC-LR對下丘腦-垂體-睪丸軸激素軸的影響及作用靶點一、目的建立MC-LR染毒Balb/c小鼠、SD大鼠模型,檢測不同濃度MC-LR連續(xù)作用對下丘腦-垂體-睪丸軸的影響,評估MC-LR雄性內分泌毒性。鑒定MC-LR在下丘腦、垂體組織中的分布;通過添加GnRH抑制劑或GnRH,確定MC-LR在下丘腦-垂體-睪丸軸的作用靶點。二、方法1、Balb/c雄性成年小鼠腹腔注射MC-LR(0,3.75,7.5,15,30μg/kg.b.w),連續(xù)注射1天,4天,7天,14天后,摘眼球取血,頸椎脫臼處死小鼠。檢測小鼠體重變化,檢測血清LH、FSH、睪酮變化;RT-PCR檢測下丘腦-垂體-睪睪 中主要分子 Kiss-1,GPR54,GnRH,GnRHr,LHβ,FSHβ,LHr,FSHr表達變化。2、檢測MC-LR對SD大鼠的LD50劑量�；贚D50,成年SD大鼠腹腔注射MC-LR30μg/kg.b.w,續(xù)注射1,3,5,7,14天后,眼球取血,頸椎脫臼處死小鼠。利用放免法檢測血清中GnRH、LH、FSH及睪酮水平;TUNEL法鑒定下丘腦細胞凋亡情況。3、MC-LR腹腔注射SD雄性大鼠(100μg/kg.b.w),動物p死前頸椎脫臼處死。Western Blot鑒定MC-LR是否進入下丘腦和垂體組織。免疫熒光共定位檢測MC-LR是否進入下丘腦GnRH神經元。4、體外培養(yǎng)GT1-7細胞系,免疫熒光染色GPR54和GnRH鑒定細胞。1000nM MC-LR染毒GT1-7細胞24小時后,免疫熒光鑒定MC-LR是否進入細胞內。5、成年SD大鼠皮下注射西曲瑞克(0.313,0.625,1.25mg/kg.b.w)12小時,檢測LH、FSH轉錄及血清睪酮水平變化,選擇最有效作用濃度。6、基于上述實驗中,成年SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30 μg/kg.b.w 5天后血清中GnRH到達峰值,給予給藥動物補注射GnRH抑制劑西曲瑞克;基于預實驗中SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30 μg/kg.b.w 14天后,GnRH水平顯著下降,給予給藥動物補注射GnRH。摘眼球取血,檢測血清中LH、FSH和睪酮水平變化,判斷GnRH是否為MC-LR作用后,血清LH、FSH和睪酮變化的使動因素。三、結果1、Balb/c 雄性成年小鼠腹腔注射 MC-LR(0,3.75,7.5,15,30 μg/kg.b.w)1,4,7天后,小鼠體重沒有發(fā)生顯著變化;注射14天后,30μg/kg.b.w組小鼠體重顯著下降。注射1天時,30μg/kg.b.w組小鼠血清LH、睪酮均上升;注射4天后,15μg/kg.b.w組小鼠血清LH、FSH及睪酮水平也發(fā)生上升;而注射7天后,30 μg/kg.b.w組小鼠血清LH、FSH及睪酮出現(xiàn)輕微下降;注射14天后,所有MC-LR注射小鼠血清LH及睪酮顯著低于正常水平。RT-PCR結果顯示,MC-LR染毒沒有改變Kiss-1,GPR54,GnRHr,LHr,FSHr的表達水平;LHβ,FSHβ的表達水平與血清呈相同趨勢,但GnRH表達水平隨著MC-LR染毒濃度和作用時間的加強,顯著降低。2、SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30μg/kg.b.w染毒1,3,5天時,血清中GnRH、LH、FSH、睪酮均呈現(xiàn)上升趨勢,第五天達到峰值;染毒7,14天時,血清中GnRH、LH、FSH和睪酮均迅速下降,且4種激素變化趨勢一致。TUNEL法鑒定發(fā)現(xiàn),MC-LR染毒1,3,5天時,沒有觀察到顯著的凋亡變化,而染毒7,14天時,可觀察到下丘腦弓狀核和室前核明顯的細胞凋亡。3、MC-LR腹腔注射SD雄性大鼠(100 μg/kg.b.w)后,Western Blot檢驗結合在PP蛋白上的MC-LR,結果表明MC-LR進入下丘腦組織,不進入垂體組織。下丘腦組織連續(xù)切片,通過免疫熒光示蹤,熒光標記免疫MC-LR及GnRH,結果可觀察到下丘腦存在MC-LR和GnRH雙陽性的細胞,即MC-LR可有效進入下丘腦GnRH神經元。4、免疫熒光標記GPR54和GnRH,觀察到細胞系雙陽性,證明該細胞為GT1-7細胞,具有合成GnRH的能力。免疫熒光標記MC-LR表明,MC-LR可有效進入GT1-7細胞。5、通過檢測LH、FSH轉錄水平和血清睪酮水平,認為西曲瑞克腹腔注射0.625 mg/kg.b.w12小時后,對LH、FSH及血清睪酮水平抑制最為顯著。6、成年SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR30 μg/kg.b.w 5天后,給藥動物補注射GnRH抑制劑后,可觀察到血清中LH、FSH和睪酮均恢復到正常水平;7、成年SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30 μg/kg.b.w 14天后,給藥動物補注射GnRH,可觀察到血清中LH、FSH和睪酮恢復到正常水品。四、結論MC-LR在下丘腦-垂體-睪丸軸的作用靶點為GnRH神經元,可導致GnRH轉錄水平的顯著下降,并導致GnRH釋放水平先升高后下降,進而引發(fā)LH、FSH、睪酮水平同步先升高后下降。第三部分MC-LR對GT1-7細胞毒性和合成及分泌GnRH影響的分子機制一、目的建立GnRH神經元細胞系(GT1-7 cells)模型,研究MC-LR對GT1-7細胞的影響;探索MC-LR對GT1-7細胞產生毒性的分子機制;探索MC-LR影響GT1-7細胞合成及分泌GnRH的分子機制。二、方法1、MC-LR(0,1,10,100,1000,10000nM)染毒 GT1-7 細胞 48h 后,CCK-8法檢測細胞活力,LDH法檢測細胞膜泄露率,TUNEL法檢測細胞凋亡狀況。2、MC-LR1000nM染毒GT1-7細胞48 h后,采用凋亡抗體芯片技術篩選明顯變化的蛋白,Q-PCR法驗證陽性蛋白。3、MC-LR(0,1,10,100,1000,10000nM)染毒 GT1-7 細胞 48h 后,取 2小時內的細胞培養(yǎng)液檢測GnRH濃度,Q-PCR法檢測GnRH轉錄水平變化。Elisa法檢測細胞cAMP、Ca2+濃度,Elisa法檢測細胞AC的活力變化;Q-PCR法檢測GnRH轉錄因子Oct-1、Otx2、Pbx1α、Dlx2、Fos和Jun的表達變化。三、結果1、CCK-8及LDH結果表明,隨著MC-LR作用濃度升高,細胞活力顯著下降,LDH顯著上升;TUNEL法檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn),MC-LR可顯著誘導GT1-7細胞凋亡。2、凋亡芯片結果表明,部分凋亡相關蛋白Bax、Bid表達上調,Bcl-2、Bcl-w、p53、IGF-2、IGFbp-2、IGFbp-4、IcIAP-2、sTNF-R1 和 sTNF-R2 表達下調。Q-PCR 檢驗其中 Bcl-2、p53、IGF-2、IGFbp-2、IGFbp-4,結果與凋亡芯片結果相符。3、MC-LR染毒GT1-7細胞后,可觀察到細胞培養(yǎng)液中GnRH濃度隨MC-LR作用濃度的升高,呈先升高后下降的顯著趨勢;Q-PCR結果表明,GnRH轉錄水平隨著MC-LR作用濃度升高顯著下降。細胞內cAMP、Ca2+顯著上調,AC活力顯著上調。轉錄增強子Oct-1、Otx2、Pbx1a、Dlx2顯著下調,轉錄抑制因子fos顯著上調,jun顯著下調。四、結論1、MC-LR對GT1-7細胞具有強烈毒性,可通過下調bcl-2、bcl-w、p53、IGF-2、IGFbp-2、IGFbp-4、IcIAP-2、sTNF-R1 和 sTNF-R2,上調 bax 和 bid 誘發(fā)細胞凋亡。2、MC-LR 可下調 GnRH 轉錄激活因子 Oct-1、Otx2、Pbx1a、D1x2,上調 GnRH轉錄抑制因子c-jun水平,進而引發(fā)GnRH轉錄水平顯著下降。3、MC-LR顯著上調細胞內Ca2+水平,激活AC,引發(fā)cAMP顯著增多,刺激GnRH釋放增加,并最終由于GnRH轉錄水平下降,GnRH釋放水平繼而下降。
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【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R99

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本文編號：2145063