【摘要】：隨著萬古霉素耐藥性的發(fā)生和發(fā)展,處于Ⅲ期臨床研究的雷莫拉寧是一個(gè)具有良好前景的抗耐藥菌候選藥物。通過對(duì)雷莫拉寧的結(jié)構(gòu)修飾,獲得更好抗菌活性雷莫拉寧類似物是非常有誘惑力,然而實(shí)驗(yàn)室保存的三株雷莫拉寧基因工程菌株,它們的發(fā)酵產(chǎn)量非常低,阻礙了后續(xù)的研究。本論文首先對(duì)三株基因工程菌種復(fù)壯、自然選育,經(jīng)過初篩復(fù)篩最終獲得:發(fā)酵效價(jià)為489μg/mL的產(chǎn)無糖雷莫拉寧菌株SIPI-A.dorf29-2016、發(fā)酵效價(jià)為368μg/mL的產(chǎn)無氯雷莫拉寧菌株SIPI-A.dorf20-2016和發(fā)酵效價(jià)為476μg/mL產(chǎn)無氯無糖雷莫拉寧菌株SIPI-A.dorf20-dorf29-2016。三者均比其出發(fā)菌株發(fā)酵效價(jià)有了不同程度的提高。通過考察單因素,組合因素實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件的一系列優(yōu)化,最終發(fā)酵單位比現(xiàn)有的發(fā)酵水平總體再次提高了2倍。通過對(duì)無糖雷莫拉寧發(fā)酵液的前處理?xiàng)l件的摸索,建立了成熟的初提方法。隨后對(duì)大孔吸附樹脂NM100,SP825的分離能力的考察及對(duì)色素去除的研究,摸索出來獲得無糖雷莫拉寧粗品分離工藝。此工藝可以很好地去除色素,富集純度大于90%的無糖雷莫拉寧。在此基礎(chǔ)上經(jīng)中低壓制備條件與高壓半制備條件的優(yōu)化,探索出來一條獲得無糖雷莫拉寧精制的分離工藝。整個(gè)分離工藝的總收率在55%左右。此工藝可以獲得液相純度大于98%無糖雷莫拉寧。整個(gè)工藝適用于無氯雷莫拉寧與無氯無糖雷莫拉寧的分離與純化。抗菌活性檢測(cè)的結(jié)果顯示,三種雷莫拉寧類似物與其本身的抑菌活性相當(dāng),并無差別。氯原子的缺失對(duì)活性沒有造成影響。為了進(jìn)一步理解雷莫拉寧的生物合成機(jī)制,在大腸桿菌中異源表達(dá)了雷莫拉寧的鹵化酶,通過對(duì)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在TransB(DE3)宿主加入膜增溶劑苯甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,可以獲得可溶性蛋白。生物信息學(xué)研究表明鹵化酶的催化過程需要FADH2的參與,因此構(gòu)建了FAD還原酶E.coliBL21-Fre菌株,經(jīng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化后,可以獲得大量可溶性蛋白,測(cè)得粗酶液的酶活為3U/ml。為探索獲得多樣性氯化的新的雜合糖肽類抗生素奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:With the occurrence and development of vancomycin resistance, Ramolanine, which is in stage 鈪，

本文編號(hào)：2144557