【摘要】：TPN729是一種新型的用于治療勃起功能障礙的磷酸二酯酶-5(PDE5)抑制劑,目前在中國已進入臨床開發(fā)階段。與已上市的PDE5抑制劑(西地那非、伐地那非、他達拉非和阿伐那非)相比,TPN729表現(xiàn)出了更好的PDE5選擇性,對PDE6及PDE11的抑制活性分別低于西地那非和他達拉非,因此不良反應(yīng)少,而且半衰期相比西地那非得到有效延長。本課題系統(tǒng)研究了TPN729在人體內(nèi)的代謝與藥動學,評價了其在代謝酶和轉(zhuǎn)運體方面引發(fā)藥物-藥物相互作用的可能性,為TPN729進一步的藥物開發(fā)提供依據(jù),同時還考察了其作為多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的開發(fā)潛力。1.人體內(nèi)的代謝與藥動學研究三名健康受試者口服25 mg TPN729后,收集不同時間點的血漿和0-24 h尿樣和糞樣,采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法(UPLC/Q-TOF MS)檢測并鑒定體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明,口服TPN729后在人體內(nèi)共檢測到22種代謝產(chǎn)物,通過合成對照品的方式確認了其中7種代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),包括:M3(N-去四氫吡咯乙基)、M8(四氫吡咯氧化脫胺)、M11-1(丙氧基羰基化)、M11-2(四氫吡咯羰基化)、M12-2(丙氧基單氧化)、M12-3(丙氧基單氧化)和M13(四氫吡咯氧化開環(huán))。TPN729在人體內(nèi)經(jīng)歷廣泛代謝,代謝途徑包括氧化脫胺、N-去烷基、氧化開環(huán)、羥基化、羰基化、N-氧化、脫氫及葡萄糖醛酸結(jié)合,代謝反應(yīng)多發(fā)生于四氫吡咯側(cè)鏈。通過代謝物對照品的人肝細胞孵化實驗,確認M3可進一步代謝生成M1、M2-1、M2-2、M4-1和M4-2;M11-2可代謝生成M3與M10;M12-3可生成M4-2和M11-1。醛基捕獲實驗證明M13不是由內(nèi)酰胺代謝產(chǎn)物M11-2水解開環(huán)生成,而是由原形藥物四氫吡咯氧化開環(huán)生成氨基醛并進一步氧化所生成的羧基代謝產(chǎn)物。人血漿中,達峰時刻與消除相的血漿樣品中均主要檢測到N-去四氫吡咯乙基代謝產(chǎn)物M3,其他檢測到的主要藥物相關(guān)物質(zhì)為原形藥物M0、磺酰胺N-雙去烷基代謝產(chǎn)物M2-2和內(nèi)酰胺代謝產(chǎn)物M11-2。在尿中檢測到的主要相關(guān)物質(zhì)是原形藥物M0,其他檢測到的少量代謝物主要包括羥基化代謝物M12-1和氧化脫胺代謝物M8。在糞中幾乎檢測不到原形藥物,檢測到的主要代謝物M7,M8和M13分別為四氫吡咯發(fā)生氧化脫胺或氧化開環(huán)生成的代謝產(chǎn)物。結(jié)合TPN729在血漿、尿樣和糞樣中的代謝物譜表明,口服TPN729后吸收完全,TPN729在人體內(nèi)主要發(fā)生磺酰胺N-去烷基、四氫吡咯氧化開環(huán)和氧化脫胺代謝,體循環(huán)中主要為N-去烷基代謝產(chǎn)物,而未被代謝的原形藥物主要通過腎臟排泄。為測定TPN729及其主要代謝產(chǎn)物在人體內(nèi)的藥動學,建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)同時測定人血漿中的TPN729、M3、M8、M11-2和M13,并將其應(yīng)用于人體藥動學研究。結(jié)果表明,三名健康受試者口服25 mg TPN729后,TPN729和4個代謝產(chǎn)物在給藥后0.83 3.83 h達峰,其中M3達峰時間較原形M0滯后。TPN729、M3、M8、M11-2和M13的Cmax分別為35.8、125、8.26、22.0和18.6 ng/m L,AUC(0-∞)分別為289、2187、51.5、74.8和37.0 ng·h/m L。血漿中最主要的藥物相關(guān)物質(zhì)是N-去四氫吡咯乙基代謝產(chǎn)物M3,其Cmax和AUC(0-∞)分別達到原形的3.5倍和7.6倍,而其他三個代謝產(chǎn)物M8、M11-2和M13的血漿暴露量分別為原形的18%、25%和13%。TPN729和4個代謝產(chǎn)物的消除半衰期較為接近(7.75 11.6 h),其中M3的消除略慢于M0。2.基于代謝酶和轉(zhuǎn)運體的藥物相互作用研究基于代謝酶的藥物相互作用研究中,采用體外代謝模型和體內(nèi)動物模型考察了TPN729引起藥物相互作用的可能性。體外酶表型實驗采用重組酶和選擇性抑制劑孵化實驗,結(jié)果表明TPN729是CYP3A4的敏感底物,CYP3A4對TPN729體外代謝的貢獻達到70%,酮康唑(CYP3A抑制劑)和1-氨基苯并三唑(CYP450酶廣譜抑制劑)能顯著降低TPN729的人肝微粒體代謝,提示體內(nèi)可能引起藥物相互作用。動物實驗中,比格犬給予CYP3A抑制劑酮康唑后,TPN729的體內(nèi)Cmax和AUC0-∞分別增加至2.5和7.8倍;給予CYP3A誘導劑利福平后,Cmax和AUC0-∞分別降低至36.3%和24.9%,表明同時服用CYP3A抑制劑和誘導劑會對TPN729的藥動學產(chǎn)生顯著影響。大鼠灌胃給予TPN729并聯(lián)合給予酮康唑或地塞米松(CYP3A誘導劑)獲得類似的結(jié)果,但采用靜脈注射TPN729的給藥方式時,酮康唑或地塞米松不會改變TPN729在動物體內(nèi)的藥動學,表明口服TPN729會經(jīng)歷強首過代謝,聯(lián)合服用CYP3A抑制劑或誘導劑是通過影響TPN729的首過代謝,從而改變其血藥濃度。由于TPN729臨床采用片劑口服的給藥方式,會經(jīng)歷強首過代謝,因此,應(yīng)格外關(guān)注影響CYP3A活性的藥物與TPN729之間的藥物相互作用。另外,利用CYP450酶探針底物和人肝微粒體孵化體系評價TPN729引發(fā)酶抑制的可能性,并通過提前含或不含NADPH孵育(NADPH+/-)來考察是否存在時間依賴性抑制。結(jié)果表明,無論是否提前加入NADPH,TPN729對CYP1A2、CYP2B6和CYP2D6的IC50值均大于100μM,未表現(xiàn)出直接抑制或時間依賴性抑制;TPN729對CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4的IC50 NADPH+值為3.3~9.2μM,且IC50 NADPH-/IC50 NADPH+2,表現(xiàn)出中等抑制和時間依賴性抑制。但考慮人體內(nèi)的TPN729暴露水平,預(yù)計口服臨床最高劑量TPN729(100 mg)后血漿中可達到的濃度仍遠低于上述IC50值,因此判斷臨床上TPN729通過抑制CYP450酶而產(chǎn)生藥物相互作用的可能性較小�；谵D(zhuǎn)運體的藥物相互作用研究中,采用攝取轉(zhuǎn)運體OATP1B1/1B3/2B1、OAT1、OAT3和OCT2轉(zhuǎn)染的HEK293細胞、Caco-2細胞和外排轉(zhuǎn)運體P-gp轉(zhuǎn)染的MDCKII-MDR1細胞和大鼠體內(nèi)模型考察轉(zhuǎn)運體在TPN729體內(nèi)處置過程中的作用,并進一步評價其作為轉(zhuǎn)運體底物或抑制劑引發(fā)藥物相互作用的可能性。攝取轉(zhuǎn)運體方面,TPN729在攝取轉(zhuǎn)運體細胞株上的攝取速率均與Mock相當,表明TPN729不是上述攝取轉(zhuǎn)運體的底物。同時其對攝取轉(zhuǎn)運體表現(xiàn)出弱抑制作用(IC50=17~193μM),由于IC50值遠遠高于人體內(nèi)可達到的最高血藥濃度,認為體內(nèi)不會產(chǎn)生與攝取轉(zhuǎn)運體相關(guān)的藥物相互作用。Caco-2細胞轉(zhuǎn)運實驗的結(jié)果表明TPN729的滲透性良好,但是高濃度的TPN729能夠使B側(cè)→A側(cè)的表觀滲透系數(shù)和外排比(ER)降低,提示可能對外排轉(zhuǎn)運體產(chǎn)生了抑制。MDCKII-MDR1細胞轉(zhuǎn)運實驗的結(jié)果表明TPN729是外排轉(zhuǎn)運體P-gp的底物(ER=30.8),但由于其滲透性良好,因此同時給予P-gp選擇性抑制劑不會改變TPN729在大鼠體內(nèi)的藥動學。TPN729對外排轉(zhuǎn)運體P-gp表現(xiàn)出了明顯抑制(IC50=0.75μM),由于[I]/IC50大于FDA藥物相互作用研究指導原則設(shè)定的參考值,根據(jù)指導原則的推薦,選擇地高辛作為P-gp陽性底物,開展體內(nèi)藥物相互作用試驗以評價TPN729通過抑制P-gp而產(chǎn)生藥物相互作用的可能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)臨床劑量相關(guān)的5 mg/kg TPN729能顯著升高大鼠體內(nèi)地高辛的Cmax和AUC0-∞,分別增加至對照組的3.7倍和1.95倍,對t1/2沒有影響,表明TPN729通過抑制胃腸道P-gp增加了地高辛在大鼠體內(nèi)的吸收,對地高辛的消除沒有影響。地高辛是常見的治療心血管疾病的藥物,由于地高辛的安全治療窗窄,在臨床使用過程中若聯(lián)合使用TPN729與地高辛,可能會升高地高辛在體內(nèi)的血藥濃度,尤其是升高Cmax,從而引起不良反應(yīng),本實驗也提示TPN729與其他P-gp底物在臨床上聯(lián)合使用時可能引發(fā)藥物-藥物相互作用。3.逆轉(zhuǎn)多藥耐藥研究上述研究已表明TPN729對外排轉(zhuǎn)運體P-gp具有顯著的抑制作用,而外排轉(zhuǎn)運體P-gp過表達是腫瘤細胞形成多藥耐藥的主要原因之一。本實驗采用過表達P-gp的人肺腺癌紫杉醇耐藥細胞株A549/T作為體外模型,結(jié)合裸鼠體內(nèi)移植瘤模型,考察TPN729是否能通過抑制腫瘤細胞表面過表達的P-gp,減少腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的外排,從而恢復腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性,起到逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用。細胞系的選擇方面,前期在大鼠體內(nèi)的組織分布實驗結(jié)果表明,TPN729在肺組織的濃度較高,濃度約為血漿的100倍。由此根據(jù)TPN729在人血漿中的Cmax,預(yù)計在人體內(nèi)肺組織的濃度可達到10 u M,高于體外MDCKII-MDR1細胞系中測得的IC50值。因此,本實驗采用過表達P-gp的人肺腺癌紫杉醇耐藥細胞株A549/T作為體外模型,采用抗腫瘤藥物紫杉醇和阿霉素作為P-gp的底物,考察TPN729對多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用,并進一步建立A549/T裸鼠移植瘤模型驗證TPN729是否能在體內(nèi)發(fā)揮腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果顯示TPN729能夠顯著降低紫杉醇和阿霉素對A549/T的IC50,恢復腫瘤細胞對這兩種P-gp底物的敏感性(逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為22.9與5.35),而不改變耐藥細胞株對順鉑(非P-gp底物)的藥物敏感性,也不改變抗腫瘤藥物對敏感細胞株的IC50,同時TPN729可以增強紫杉醇誘導的耐藥細胞凋亡,處于凋亡早期及晚期的細胞比例共增加約30%,這些結(jié)果表明TPN729能通過抑制P-gp增強抗腫瘤藥物的細胞毒作用,表現(xiàn)出多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用。機制實驗考察了TPN729對抗腫瘤藥物在耐藥細胞中積累的影響以及TPN729對P-gp蛋白表達的影響。結(jié)果顯示TPN729(10μM)可以增加耐藥細胞內(nèi)紫杉醇濃度至對照組的4.1倍,升高耐藥細胞內(nèi)的阿霉素濃度為對照組的6.8倍,且TPN729對耐藥細胞中抗腫瘤藥物積累的增加表現(xiàn)出濃度依賴性。TPN729不會影響P-gp蛋白的表達,通過直接抑制P-gp的功能減少抗腫瘤藥物的外排,從而增加抗腫瘤藥物在耐藥細胞中的積累。建立A549/T裸鼠體內(nèi)移植瘤模型之后,比較了單獨給予紫杉醇和聯(lián)合給予TPN729和紫杉醇后腫瘤的生長情況。給藥14天后,A549/T移植瘤對紫杉醇表現(xiàn)出耐藥性,5 mg/kg的紫杉醇抑瘤效果較弱,但同時給予TPN729和紫杉醇可以明顯增強紫杉醇的抑瘤效果,顯著減緩腫瘤的生長,第14天紫杉醇組和聯(lián)合給藥組的平均腫瘤重量分別為對照組的89%和34%,平均腫瘤體積分別為對照組的83%和37%。體內(nèi)腫瘤組織的細胞凋亡采用TUNEL法進行檢測,實驗結(jié)果驗證了TPN729增強了紫杉醇誘導的耐藥腫瘤組織細胞凋亡,從而抑制腫瘤生長。A549/T裸鼠體內(nèi)移植瘤實驗結(jié)果表明TPN729能在體內(nèi)發(fā)揮多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用,減緩腫瘤生長,未來可以考慮開發(fā)TPN729作為新型多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑。4.結(jié)論TPN729在人體內(nèi)發(fā)生廣泛代謝,代謝途徑包括氧化脫胺、N-去烷基、氧化開環(huán)、羥基化、羰基化、N-氧化、脫氫及葡萄糖醛酸結(jié)合�？诜⺄PN729后吸收完全,血漿中主要檢測到的藥物相關(guān)物質(zhì)是N-去四氫吡咯乙基代謝產(chǎn)物M3,而未被代謝的原形藥物主要通過腎臟排泄。TPN729是CYP3A4的敏感底物,口服TPN729會經(jīng)歷強首過代謝,聯(lián)合服用CYP3A抑制劑或誘導劑會影響TPN729的首過代謝,從而改變其血藥濃度,影響其安全性和有效性。TPN729對外排轉(zhuǎn)運體P-gp表現(xiàn)出明顯抑制,臨床劑量相關(guān)的TPN729能顯著升高大鼠體內(nèi)地高辛的暴露。TPN729與其他P-gp底物在臨床上聯(lián)合使用時可能引發(fā)藥物-藥物相互作用,安全性值得關(guān)注。TPN729能夠濃度依賴性地抑制耐藥腫瘤細胞表面過表達的P-gp,增加抗腫瘤藥物在耐藥腫瘤細胞中的積累,從而恢復腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性,起到逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用,在移植瘤裸鼠體內(nèi)可有效增加紫杉醇誘導的腫瘤細胞凋亡,并顯著減緩腫瘤生長,未來可考慮開發(fā)其作為P-gp介導的多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院上海藥物研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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本文編號：2144234