【摘要】：本文以米氏凱倫藻、小球藻兩種海洋微藻為材料,優(yōu)化了米氏凱倫藻多糖的制備工藝,經(jīng)乙醇分級(jí)沉淀獲得微藻多糖,并對(duì)微藻多糖進(jìn)行抑制腫瘤血管生成活性及在分子水平上研究其對(duì)相關(guān)蛋白的表達(dá)。通過比較索氏提取法、超聲提取法、閃式破碎提取法、閃式破碎結(jié)合蛋白酶水解法對(duì)米氏凱倫藻多糖提取率的影響,選擇閃式破碎結(jié)合酶解方法提取多糖,優(yōu)選堿性蛋白酶進(jìn)行酶解,確定米氏凱倫藻多糖酶解較優(yōu)的提取條件為:酶解溫度40℃、酶解pH 8.5、酶用量為藻粉重量的2.5%、酶解時(shí)間為2h,在此條件下米氏凱倫藻多糖的提取率可達(dá)9.71%。30%、50%、80%乙醇分級(jí)沉淀依次獲得米氏凱倫藻多糖組分KPS1、KPS2、KPS3和小球藻多糖組分CPS1、CPS2、CPS3。采用雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型實(shí)驗(yàn),對(duì)上述微藻多糖進(jìn)行活性篩選,篩選出KPS1、KPS2、CPS1、CPS2均具有抑制血管生成的潛在作用。采用MTT法(四氮唑藍(lán)試驗(yàn))測(cè)定發(fā)現(xiàn),六種微藻多糖對(duì)正常狀態(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)基本沒有毒性。10%的人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)液能夠明顯促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,而米氏凱倫藻多糖和小球藻多糖能夠在一定程度上拮抗腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的誘導(dǎo)作用。通過細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)(Wound Healing assay)發(fā)現(xiàn)10%人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)液能夠明顯促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,米氏凱倫藻多糖中KPS1、KPS2能拮抗其誘導(dǎo)作用,一定濃度范圍內(nèi)其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。小球藻多糖中CPS1、CPS2對(duì)肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移抑制作用較為突出,其中CPS2在5μg/m L-100μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的濃度梯度趨勢(shì)。通過WesternBlot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)的人臍靜脈細(xì)胞MMP-9和VEGF相關(guān)蛋白表達(dá)量增高,米氏凱倫藻多糖KPS1在100μg/mL時(shí)對(duì)MMP-9的表達(dá)具有顯著的抑制作用(P0.05)推測(cè)米氏凱倫藻多糖可能是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-9相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其抑制腫瘤血管生成的活性。米氏凱倫藻多糖KPS2、KPS3均有不同程度的抑制誘導(dǎo)其VEGF相關(guān)蛋白表達(dá)的增加,其中KPS2在濃度50μg/mL、100μg/m L中均有顯著抑制作用。小球藻多糖并沒有明顯的抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-9相關(guān)蛋白的表達(dá),推測(cè)小球藻多糖抑制腫瘤血管生成活性可能不是通過MMP-9因子相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。小球藻多糖均有不同程度的降低HUVECs中VEGF蛋白的表達(dá),其中以CPS1和CPS3在濃度為100μg/mL下具有較為顯著的抑制作用,提示小球藻多糖具有一定的抑制內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs中VEGF蛋白的表達(dá)。在對(duì)VEGF的受體VEGF-R1進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),濃度為100μg/mL的CPS1和50μg/mL、100μg/mL的CPS2具有顯著的抑制作用,表明小球藻多糖對(duì)肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs中VEGF-R1蛋白的表達(dá)具有一定的抑制作用。
[Abstract]:In this paper, two kinds of marine microalgae, Karen's and Chlorella, were used as materials to optimize the preparation process of the polysaccharides from Karen's algae and Chlorella micronuginosa. The polysaccharides were obtained by ethanol fractionation. Microalgae polysaccharides were used to inhibit tumor angiogenesis and to study the expression of related proteins at molecular level. By comparing the effects of Soxhlet extraction, ultrasonic extraction, flash crushing combined with protease hydrolysis on the extraction rate of polysaccharides from Kellenella mirabilis, the polysaccharides were extracted by flash crushing combined with enzymatic hydrolysis. Alkaline protease was selected for enzymatic hydrolysis, and the optimum extraction conditions were determined as follows: the temperature of enzymatic hydrolysis was 40 鈩，

本文編號(hào)：2128784