本文選題：TfR + 抗體　； 參考：《華中科技大學》2016年博士論文

【摘要】：[背景及目的]惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療主要依然是手術及放化療。傳統(tǒng)的放化療在殺死腫瘤細胞的同時,對其他器官的正常組織細胞也產(chǎn)生極大的損害,產(chǎn)生的毒副作用不利于患者的預后及生存質量。靶向治療相對于傳統(tǒng)的腫瘤治療,不會損傷正常的組織細胞,毒副作用更小。靶向納米醫(yī)學旨在改善治療藥物的生物分布,增加全身應用時藥物在靶部位的蓄積。靶向治療的關鍵點之一是選擇腫瘤特異性的靶點。轉鐵蛋白受體(transferrin receptor,TfR)是腫瘤細胞相對特異性的表面標志,其高表達與腫瘤分級分期及預后密切相關。TfR的高表達、胞外段易觸及其受體介導的內吞途徑使其成為抗腫瘤靶向治療中的熱點靶點之一。課題組前期研究證明,抗TfR單克隆抗體可以高效識別腫瘤細胞,與化療藥物協(xié)同作用對于多種不同組織來源的腫瘤細胞具有良好的抗瘤效應,然而其抗體單獨應用抗瘤效應相對較低。本課題設計,利用抗TfR抗體能與腫瘤細胞表面的高表達的TfR結合的特點,構建新型納米靶向分子HPPS-mAb,鑒定其與腫瘤細胞的結合特異性和其生物學活性,為腫瘤的靶向定位、顯像示蹤和靶向治療研究奠定基礎。本研究通過設計抗體連接長循環(huán)的納米載體,達到主動靶向腫瘤細胞的目的,同時希望解決目前靶向研究中存在外周血“攔截”、非特異性吸收和生理性屏障等難題。研究選用仿HDL脂蛋白納米顆粒HPPS,具有粒徑可控、生物相容性好、免疫原性低等優(yōu)點。小分子干擾RNA(siRNA)能夠通過特異性沉默某基因發(fā)揮抗瘤作用,然而其相對較大的分子量、聚陰離子的性質、易被酶促降解,且體內難以輸送到細胞內,限制了其體內應用�；诖�,本研究在TfR抗體靶向研究基礎上,利用膽固醇修飾的siRNA可以高效偶聯(lián)在HPPS磷脂分子層這一特點,設計構建新型納米靶向分子HPPS-mAb,具有靶向高表達TfR腫瘤細胞的特性,將攜帶的治療性siRNA特異性定位腫瘤組織并與腫瘤細胞結合,通過受體介導的內吞途徑介導siRNA釋放入胞漿,執(zhí)行RNAi,從而起到腫瘤顯像與殺傷腫瘤雙重效應,且可發(fā)揮HDL多肽-脂質納米載體HPPS熒光納米顯像特性。通過研究為靶向腫瘤分子顯像與抗瘤效應探索新的思路,對腫瘤的靶向顯像與靶向治療新途徑的探索具有十分重要的意義。[方法]1.TfR單克隆抗體在腫瘤細胞HepG2、穩(wěn)轉細胞CHO-hTfR中靶向特異性的鑒定選擇不表達人TfR的CHOvec及CHO細胞,高表達TfR的腫瘤細胞HepG2、穩(wěn)定表達人TfR的CHO-hTfR細胞,采用流式細胞術(FCM)檢測抗TfR單克隆抗體與細胞的結合；采用激光共聚焦顯微鏡技術分析上述細胞與TfR mAb的結合特異性,并與TfR的天然配體Tf進行對比。2. TfR mAb在活細胞中內吞途徑的動態(tài)觀察以穩(wěn)定表達hTfR的CHO-hTfR為細胞模型,利用共聚焦顯微鏡技術觀察TfR mAb與TfR結合后介導內吞的循環(huán)路徑,同時固定觀察不同的循環(huán)時間點,與早期內體與晚期溶酶體的共定位情況,比較其與天然表達的TfR介導內吞途徑的差異。3. HPPS-TfR mAb的構建、純化及表征鑒定利用抗體的-SH修飾方法將HPPS與mAb進行偶聯(lián),構建完成的靶向-IPPS-mAb納米顆粒經(jīng)FPLC純化及鑒定；同時進行相關粒徑及Zeta電位的表征檢測。4. HPPS-mAb體外TfR靶向功能鑒定1μM DIR-BOA的納米顆粒HPPS-mAb與CHO-TfR共孵育,采用激光共聚焦顯微術觀察其在細胞內與TfR的共定位;不同濃度的HPPS及HPPS-mAb分別與多種腫瘤細胞系共孵育,流式細胞術檢測細胞內DIR-BOA的熒光強度變化,以此表征細胞對納米顆粒的攝取;相同數(shù)量的不表達hTfR的CHO與穩(wěn)定表達hTfR的CHO-hTfR細胞混合后,與同等濃度的HPPS與HPPS-mAb共孵育,流式細胞術檢測CHO-hTfR細胞對HPPS-mAb的特異性攝取。5. HPPS-Isotype的功能鑒定及HDL對納米顆粒的抑制作用檢測構建HPPS-Isotype作為HPPS-mAb的同型對照,比較包括HPPS在內的三種納米顆粒被細胞攝取的情況：同時利用HDL封閉HepG2細胞的表面SR-BI受體,流式細胞術檢測對納米顆粒的抑制作用。6. HPPS-mAb在U87裸鼠荷瘤模型中靶向聚集效應檢測建立U87細胞的裸鼠移植瘤模型,將含10nmol DIR-BOA的HPPS/HPPS-mAb兩種納米顆粒經(jīng)尾靜脈注射進小鼠體內,注射后3小時、12小時、24小時、48小時、72小時采用活體熒光成像系統(tǒng)分別檢測小鼠全身的DIR-BOA熒光分布。7. HPPS-mAb在CHOvec/CHO-hTfR雙側裸鼠荷瘤模型中靶向聚集效應檢測建立雙側移植瘤模型,左側為不表達hTfR的CHOvec細胞荷瘤模型,右側為穩(wěn)定表達hTfR的CHO-hTfR細胞荷瘤模型,經(jīng)尾靜脈注射HPPS-mAb,在不同的時間點觀察納米顆粒在兩瘤體部位的聚集情況,比較兩不同瘤體的時間聚集效應；分離瘤體制備成單細胞懸液,檢測瘤細胞對納米顆粒的攝取。8. HPPS-mAb/siRNA誘導HepG2細胞survivin分子的基因沉默效應檢測不同濃度的chol-si-survivin與chol-si-NC進行混合后與HPPS-mAb共孵育,構建成HPPS-mAb/siRNA納米顆粒；不同濃度的siRNA的HPPS-mAb/siRNA處理HepG2細胞48小時,檢測其對細胞內survivin mRNA表達的沉默作用。9. HPPS-mAb/siRNA誘導HepG2細胞survivin分子蛋白水平沉默效應及細胞凋亡檢測不同濃度的HPPS-mAb/siRNA處理HepG2細胞48小時,Western blot檢測其對細胞內survivin分子蛋白水平的沉默作用：利用Annexin V/PI雙染法檢測HPPS-mAb /siRNA誘導HepG2細胞48h的細胞凋亡效應。[結果]1.TfR mAb與細胞表面TfR的結合特異性流式細胞術檢測TfR mAb與腫瘤細胞表面TfR結合的陽性率,結果表明,穩(wěn)定表達hTfR的CHO-hTfR細胞與TfR mAb的結合陽性率(99.3%)與天然高表達TfR的HepG2細胞(99.03%)沒有明顯差異,提示CHO-hTfR細胞可穩(wěn)定表達人TfR,且高表達,可作為細胞模型研究受體介導的內吞作用；而不表達人TfR的CHO和CHOvec細胞與TfR mAb結合率低于5%;激光共聚焦顯微術結果可見,PE標記的mAb可以與HepG2及CHO-hTfR結合,并且與TfR-EGFP有共定位,其結合特性與TfR天然配體Tf無明顯差異,但PE標記的mAb與CHOvec無結合,提示CHO和CHOvec均可作為細胞模型對照研究。2. TfR mAb在CHO-hTfR中的內吞動態(tài)及其胞內定位激光共聚焦顯微術對CHO-hTfR的活細胞實時成像結果表明,PE標記的mAb與TfR-EGFP結合后,即可觸發(fā)TfR介導的內吞途徑：細胞表面均勻分布的熒光出現(xiàn)“顆�；爆F(xiàn)象,繼而向胞內移動,并進一步向核周移動；20rmin時間點,一部分小囊泡結構失去了EGFP熒光；進一定通過胞內定位可見,早期黃色熒光與內體標志EEA-1有共定位,在30mmin時,TfR-mAb復合體與溶酶體標志分子LAMP-1有共定位。結果表明,mAb觸發(fā)的TfR介導的內陷化基本符合天然表達的TfR介導的內吞途徑,但又有其自身特點。3.靶向納米顆粒HPPS-mAb的構建、純化及其表征鑒定改造的HPPS納米顆粒由華中科技大學武漢光電國家實驗室生物醫(yī)學光子學功能實驗室合成,TfR mAb經(jīng)-SH修飾后,與改造后的HPPS發(fā)生反應,偶聯(lián)在HPPS納米載體的表面：經(jīng)FPLC純化,收集偶聯(lián)成功的納米顆粒；經(jīng)純化后的靶向納米顆粒HPPS-mAb純化曲線結果表明,偶聯(lián)完成后TfRmAb的保留時間明顯提前,峰值與HPPS也有明顯區(qū)別,說明mAb已與HPPS偶聯(lián)。進一步經(jīng)粒徑檢測儀檢測納米顆粒的粒徑,可知HPPS-mAb約為29nnm,其尺寸略大于未偶聯(lián)的HPPS。4. HPPS-mAb可以經(jīng)TfR介導內吞進入細胞,并且TfR的偶聯(lián)可以促進多種腫瘤細胞對納米顆粒的攝取HPPS-mAb與CHO-hTfR共孵育后,激光共聚焦顯微鏡技術觀察可見HPPS的標記熒光DIR-BOA與TfR-EGFP有共定位,表明HPPS-mAb的攝取由TfR介導內吞完成。當不同濃度的HPPS與HPPS-mAb作用于HepG2時,相同的作用濃度,HPPS-mAb表現(xiàn)出更高的攝�。划斪饔糜谄渌喾N腫瘤細胞系時,HPPS-mAb表現(xiàn)出不同的靶向促進作用,HPPS-mAb的攝取是HPPS的2-5倍不等。5. HPPS-mAb在混合細胞中靶向功能的鑒定相同數(shù)量的CHOvec與CHO-hTfR細胞混合后,分別于HPPS及HPPS-mAb共孵育,結果表明,HPPS-mAb可以被特異地遞呈進入TfR+的CHO-hTfR細胞中,并隨著TfR表達強度的增加,HPPS-mAb的攝取越高。6. HPPS-Isotype的功能鑒定及HDL對納米顆粒的抑制作用檢測構建HPPS-mAb的同型對照Isotype有利于更好地在體內進行HPPS-mAb的靶向顯像研究。HPPS-Isotype對于細胞的攝取與HPPS沒有明顯區(qū)別,遠低于HPPS-mAb的攝取：當人HDL用于抑制HepG2表面的SR-BI受體時,細胞對HPPS-Isotype的攝取作用被抑制,而對HPPS-mAb僅起到了部分抑制的作用,再次提示TfR與SR-BI雙靶向機制的存在。7. HPPS-mAb在U87裸鼠移植瘤模型中的體內靶向顯像通過體內顯像檢查納米顆粒的長循環(huán)周期特性,結果表明：隨著時間延長,瘤體部位的蓄積效應越強,48小時達到頂峰;HPPS在全身熒光分布比HPPS-mAb更加廣泛,提示HPPS-mAb利于向腫瘤聚集,降低其他器官的聚集效應。8. HPPS-mAb在雙側裸鼠移植瘤模型中的體內靶向顯像進一步構建了雙側移植瘤模型進行HPPS-mAb的體內靶向鑒定,結果表明,在早期時間點24小時以前,HPPS-mAb更傾向于聚集在穩(wěn)定表達hTfR的CHO-hTfR荷瘤側,而HPPS-Isotype在雙側的蓄積沒有明顯差異。9. HPPS-mAb/siRNA誘導HepG2細胞survivin分子的基因沉默效應不同siRNA濃度的HPPS-mAb/siRNA作用于HepG2細胞48h,RT-PCR檢測其細胞內Survivin mRNA表達水平變化,結果表明,在chol-si-survivin在400nM時,HPPS-mAb/siRNA明顯抑制survivin mRNA的表達,沉默效率達62%;HPPS-Isotype/siRNA也起到了一定的基因沉默,但其作用程度低于HPPS-mAb/siRNA,沉默效率低于50%。10. HPPS-mAb/siRNA誘導HepG2細胞survivin蛋白表達的沉默效應及細胞凋亡效應不同濃度的HPPS-mAb/siRNA作用于HepG2細胞48h,WB檢測細胞survivin蛋白表達水平變化,結果表明,當siRNA作用濃度達400nM時,HPPS-mAb/siRNA明顯降低了細胞survivin表達水平,為未處理組的35.2%。流式檢測48h對HepG2細胞誘導細胞凋亡的作用,表明siRNA作用濃度400nnM組,HepG2產(chǎn)生了明顯的細胞凋亡,早期凋亡達19.7%。[結論]本課題在TfR抗體靶向研究基礎上,設計構建了TfR新型納米顆粒HPPS-mAb,并探討了其在體內外靶向TfR腫瘤顯像及其輸送siRNA的作用。研究發(fā)現(xiàn)：①TfR介導mAb內吞研究發(fā)現(xiàn),TfR-mAb復合物的內吞途徑與Tf-TfR循環(huán)不完全一致,亦不同于鐵剝奪類抗TfR抗體觸發(fā)的TfR降解途徑,有其自身特點,作為靶向配體應用于納米載體的遞呈,能夠高濃度蓄積在靶部位;②HPPS-mAb在體外能夠被腫瘤細胞高效攝��；mAb的偶聯(lián)明顯促進了細胞對納米顆粒HPPS的攝取：HDL能夠抑制HPPS的攝取而對HPPS-mAb僅有部分抑制作用,提示新型靶向納米顆粒HPPS-mAb對細胞具有雙靶向作用機制;③新型靶向納米顆粒HPPS-mAb體內顯像時,24小時內,HPPS-mAb在雙側成瘤模型中更傾向于聚集在高表達hTfR的CHO-hTfR鍢荷瘤模型中,提示將HPPS-mAb應用于腫瘤早期顯像診斷的可能性。④利用膽固醇修飾的siRNA可以高效偶聯(lián)在HPPS磷脂分子層這一特點,我們成功構建HPPS-mAb/siRNA納米顆粒,將HPPS-mAb作為TfR導向的靶向survivin的納米載體,證明其在體外對高表達survivin細胞的mRNA及蛋白具有沉默作用,并可誘導腫瘤細胞凋亡,進而為TfR介導的新型納米分子HPPS-mAb靶向腫瘤分子顯像與抗瘤效應研究奠定了良好的基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 趙君賢;張英鴿;;納米粒子的靶向作用機制研究進展[J];中國醫(yī)藥生物技術;2007年05期

2 曾韋錕,任建敏,鄒全明;口服聚乙二醇改性聚乳酸靶向分布實驗[J];第三軍醫(yī)大學學報;2002年12期

3 柯筱華;王柏;李江慧;;含藥脂肪乳劑的靶向作用研究進展[J];藥學進展;2007年02期

4 李瑋;周彩存;粟波;孟淑燕;;腫瘤新生血管靶向的順磁性長循環(huán)納米脂質體的構建[J];腫瘤防治研究;2010年11期

5 ;包載親脂性抗癌前藥脂質體的免疫靶向作用[J];國外醫(yī)學.藥學分冊;1994年04期

6 何躍明;惡性腫瘤的磁靶向熱療[J];國外醫(yī)學(物理醫(yī)學與康復學分冊);2003年02期

7 王鑫;譚樹華;;RGD序列在靶向溶栓藥物方面的應用研究進展[J];臨床合理用藥雜志;2013年17期

8 胡俊東;魯雄兵;周四維;;PDE5在ED治療中的靶向作用[J];現(xiàn)代泌尿外科雜志;2006年01期

9 ;藥物納米輸送系統(tǒng)[J];技術與市場;2009年10期

10 黨萬太;苗維納;楊曉放;姜岑;;鈣調磷酸酶在附子苷對心衰調控過程中的靶向研究[J];中藥藥理與臨床;2011年02期

相關會議論文 前1條

1 周丹華;甘志華;;膠束表面的電荷對其靶向作用的影響[A];2011年全國高分子學術論文報告會論文摘要集[C];2011年

相關博士學位論文 前4條

1 宋承華;血管靶向近紅外納米載藥體系的構建及增強實體瘤藥物滲透的研究[D];西北大學;2016年

2 郭春梅;miR-429靶向作用于CRKL通過調控Raf/MEK/ERK-EMT通路抑制HepG2細胞遷移、侵襲[D];大連醫(yī)科大學;2017年

3 賀琪;新型納米分子HPPS-mAb的構建、靶向TfR腫瘤顯像及其輸送siRNA研究[D];華中科技大學;2016年

4 洪梅;艾滋病的靶向基因治療[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2000年

相關碩士學位論文 前5條

1 孟艾;LID-MWCNT基靶向緩釋載藥系統(tǒng)的制備及性能研究[D];天津醫(yī)科大學;2015年

2 王曾;長效靶向順鉑脂質體的制備及其抗腫瘤作用研究[D];吉林大學;2016年

3 廖捍斯;miR-1/206靶向調控Pax7在維甲酸誘導的C2C12細胞肌向分化異常中的作用研究[D];大連醫(yī)科大學;2016年

4 張嫣;經(jīng)皮阻滯劑提高甲硝唑皮膚局部靶向性的研究[D];天津大學;2013年

5 馬婧薇;ASGPR介導的靶向siRNA抑制HBV的復制與表達[D];華中科技大學;2009年

，

本文編號：2082545