本文選題：突觸可塑性 + 長時(shí)程增強(qiáng)��； 參考：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分神經(jīng)活動依賴的蛋白質(zhì)硫巰基化信號對大鼠海馬腦區(qū)長時(shí)程增強(qiáng)的調(diào)控作用目的：硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)是一種重要的內(nèi)源性氣體信號分子,近年來由于其與多種神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)受到廣泛關(guān)注。離子型谷氨酸受體,特別是N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR),在長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)和長時(shí)程抑制(long-term depression, LTD)等突觸可塑性形成中扮演著關(guān)鍵性的角色。有研究發(fā)現(xiàn),外源性補(bǔ)充H2S通過激活NMDAR易化海馬腦區(qū)LTP,但其機(jī)制未明。最新研究顯示,H2S通過靶向蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基進(jìn)行硫巰基化修飾(sulfhydration, SHY,由巰基-SH轉(zhuǎn)變?yōu)榱驇�基-SSH),改變靶蛋白的空間結(jié)構(gòu),從而調(diào)控其活性和功能。但是迄今為止,這種內(nèi)源性的新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在突觸可塑性中發(fā)揮何種作用還鮮有報(bào)道。因此,本部分實(shí)驗(yàn)旨在研究,神經(jīng)活動依賴的內(nèi)源性硫巰基化信號分子H2S,在大鼠海馬腦區(qū)突觸可塑性中扮演的角色。方法：給予高頻刺激(high-frequency stimulation, HFS)或高鉀刺激,采用亞甲基藍(lán)法檢測上述處理對大鼠海馬腦片H2S含量的影響；給予5-磷酸毗哆醛(pyridoxal- 5'-phosphate, PLP)依賴的H2S合成酶抑制劑羥胺(hydroxylamine, NH2OH)或氨基-氧乙酸(amino-oxyacetate,AOA)進(jìn)行藥理學(xué)阻斷,檢測上述處理在HFS條件下對大鼠海馬腦區(qū)H2S含量的影響,并運(yùn)用場電位記錄實(shí)驗(yàn)方法檢測上述處理對大鼠海馬腦區(qū)Schaffer側(cè)支至CA1通路LTP的影響；借助慢病毒表達(dá)的短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA) LV-CBS-RNAi,沉默腦中內(nèi)源性H2S合成酶胱硫醚-p-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS) ,再孵育H2S的外源性供體硫氫化鈉(sodium hydrogen sulfide, NariS)或補(bǔ)充NMDAR的共激活劑D型絲氨酸(D-serine),檢測上述處理對大鼠海馬腦區(qū)LTP的影響；孵育Nails或降解內(nèi)源性D-serine的D型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase, DAAO)或給予過量D-serine,檢測上述處理對大鼠海馬腦區(qū)LTP的影響；建立一種DAAO催化依賴的鹵化物熒光法,測定H2S對大鼠海馬腦片、原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞D-serine水平的影響。結(jié)果：(1) HFS(100 Hz)和高鉀刺激(50 mM)顯著增加大鼠海馬腦區(qū)H2S含量(Control: 100.00%±3.26%, HFS: 129.74%±2.81%; Control: 100.00%±2.55%, High KCI: 114.29% ±.93%);(2) HFS誘導(dǎo)的大鼠海馬腦區(qū)內(nèi)源性H2S生成,能被NH2OH (200μM)或AOA (100μM)所阻斷(Control: 100.00%±3.26%, HFS: 129.74%±2.81%, HFS+NH2OH: 98.39%±4.82%, HFS+AOA: 101.98%±2.15%); (3) NH2OH (200μM)或AOA(100μM)均能造成大鼠海馬腦區(qū)Schaffer側(cè)支至CA1通路LTP損傷(Control: 150.85%±5.08%, AOA: 106.42%±3.84%, NH2OH: 120.59%±5.17%); (4) LV-CBS-RNAi沉默H2S合成酶CBS表達(dá)(LV-vector: 100.00%±15.01%, LV-CBS-RNAi: 54.23%±3.39%),顯著損傷海馬腦區(qū)LTP (LV-veetor: 133.06%±3.58%, LV-CBS-RNAi: 100.05%±1.35%) ,外源性孵育Naris (100μM)或過量D-serine (100μM)均可逆轉(zhuǎn)LV-CBS-RNAi所致大鼠海馬腦區(qū)LTP損傷(LV-CBS-RNAi+NaHS: 158.50%±5.71%, LV-CBS-RNAi+D-serine: 176.33 % ±8.19%); (5)NailS (100 μM)顯著增強(qiáng)大鼠海馬腦區(qū)LTP (Controh 135.58%±1.40%,NaHS：167.17%±2.58%),這種改變可以被DAAO (0.5U/mL)所阻斷(DAAO:117.00% ±3.03%, DAAO+NaHS: 117.36%±2.86%) ;(6)預(yù)孵育過量的D-serine (100 μM)能取消Nails(100 μM )引起的大鼠海馬腦區(qū)LTP的進(jìn)一步增強(qiáng)(D-serine: 169.18%±4.90%, D-serine+NaHS: 164.14%±2.17%); (7) Nails濃度依賴性(0μM, 50μM, 100μM)地上調(diào)大鼠海馬腦區(qū)D-serine水平(Control: 100.00%±11.53%, 50μM: 130.94%±3.14%, 100 μM: 162.75%±7.50%) ,這種改變可能主要來源于星形膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞Control: 103.95%±7.93%, NailS: 133:20%±6.76%;神經(jīng)元Control; 100.00%±14.42%, NaHS:111.87%±16.83%)。結(jié)論：神經(jīng)活動誘導(dǎo)PLP依賴的、尤其是CBS依賴的內(nèi)源性H2S生成,對于NMDAR-LTP的形成是必需的,并且能夠通過星形膠質(zhì)細(xì)胞源性D-serine依賴的途徑,易化大鼠海馬腦區(qū)Schaffer側(cè)支至CAl通路的UTP。第二部分神經(jīng)活動依賴的蛋白質(zhì)硫巰基化信號調(diào)控大鼠海馬腦區(qū)長時(shí)程增強(qiáng)的機(jī)制目的：本課題研究認(rèn)為H2S對海馬LTP的調(diào)控作用和D-serine密切相關(guān)。谷氨酸釋放觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞源性D-serine釋放,但具體機(jī)制鮮為人知。絲氨酸消旋酶(serine racemase,SR)作為D-serine的合成酶,與H2S的重要合成酶CBS都表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞中。因此,本部分實(shí)驗(yàn)旨在探索,內(nèi)源性硫巰基化信號分子H2S是否通過對SR的硫巰基化修飾作用來增強(qiáng)其活性,上調(diào)其產(chǎn)物D-serine水平,從而易化大鼠海馬腦區(qū)的突觸可塑性。方法：建立DAAO催化依賴的鹵化物熒光法,測定H2S對SR活性的影響；使用SR活性抑制劑L-絲氨酸-O-硫酸酯(L-serine-O-suifate, LSOS)檢測其對D-serine水平的改變；應(yīng)用生物素開關(guān)法檢測H2S對SR硫巰基化修飾和亞硝基化修飾的影響；觀察二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT,能夠打斷二硫鍵從而阻斷硫巰基化修飾)對SR硫巰基化修飾的影響；給予大鼠海馬腦片不同頻率電刺激或高鉀刺激,檢測上述處理對海馬腦區(qū)總蛋白和SR硫巰基化修飾的影響；大鼠海馬腦片孵育NAILS或LSOS檢測上述處理對海馬腦區(qū)LTP的影響；借助電噴霧離子化質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)技術(shù)檢測NariS脫氣水溶液中多硫化物(polysulfides, H2Sn)的相對豐度；大鼠海馬腦片孵育多硫化物供體四硫化鈉(sodium tetrasulfide, Na2S4),觀察其對大鼠海馬腦區(qū)LTP的影響；采用年齡相關(guān)學(xué)習(xí)記憶損傷(aBe-associated memory impairment, AAMI)的衰老大鼠模型,觀察外源性補(bǔ)充H2S對衰老后D-serine缺乏導(dǎo)致突觸可塑性損傷的恢復(fù)作用。結(jié)果：(1)孵育Naris ( 100μM)顯著上調(diào)大鼠海馬腦區(qū)和體外重組蛋白的SR活性(大鼠海馬Control: 100.00% ±1.49%, NariS: 157.50% ±6.71%;重組蛋白Control: 100.00% ±1.38%, NariS: 137.40%±1.05%) ,并且這種改變能被LSOS (4.5 raM)所阻斷(Control: 100.00% ±11.53%, LSOS: 86.51% ±2.65%, NariS: 135.82% ±15.61%, NaHS+LSOS: 91.27% ±6.91%):(2)SR的硫巰基化修飾改變可能來源于其亞硝基化狀態(tài)(Control: 100.98%±10.73%,Vitamin C: 313.26% ± 15.25%, NariS: 321.82% ± 35.94%, NariS+Vitamin C: 324.37% ± 30.18%) ; (3) NaHS濃度依賴性(0μM, 50μM, 100μM )地上調(diào)大鼠海馬腦區(qū)總蛋白的硫巰基化修飾水平；(4) NariS ( 100μM )顯著上調(diào)大鼠海馬腦區(qū)和體外重組蛋白的SR硫巰基化修飾水平(大鼠海馬Control: 99.88%±5.60%, NaHS: 413.57%±48.34%:重組蛋白Control: 95.00% ±2.99%, NaHS: 439.81%±33.10%)并且NariS引起的SR活性改變被DTT(50μM)所阻斷(重組蛋白DTT: 100.00%±4.66%, NaHS±DTT: 108.53%:±1.13%;大鼠海馬DTT: 100.00%±2.99%, NaHS±DTT: 96.37%±9.31%):(5)不同頻率的刺激(0Hz, 1 Hz, 10Hz, 100 Hz)可上調(diào)大鼠海馬腦區(qū)SR的硫巰基化修飾水平,且具有頻率依賴性(0 Hz: 100.73%±5.29%, 1 Hz: 204.64%±11.19%, 10 Hz: 322.57%± 13.89%, 100 Hz: 506.08%±17.35%) ,高鉀刺激(50 mM)也顯著上調(diào)大鼠海馬腦區(qū)SR的硫巰基化修飾水平(Control: 100.19%±5.54%, High KCl: 181.32%±10.86%): (6) NariS( 100 μM)增強(qiáng)大鼠海馬腦區(qū)LTP的作用可被LSOS (4.5 mM)所阻斷(LSOS: 106.51% ±06%, NaHS+LSOS: 105.69%±2.73%): (7) HFS (100Hz)顯著上調(diào)大鼠海馬腦區(qū)D-serine水平(Control:100.00%±9.55%, HFS: 140.77%±8.38%) ,并可被NHzOH (200μM)或AOA ( 100μM )所阻斷(NH2OH: 94.35%±6.00%, HFS+NH2OH: 94.76%±5.27%, AOA: 95.06%±3.35%, HFS+AOA: 95.82%±5.43%) ; (8) NaHS脫氣水溶液(100μM)中檢測到多種不同豐度的多硫化物離子峰([S3]-, [S4]-, [S5]2-, [S6]2-, IS7]2-, [88]2-); (9)多硫化物供體Na2S4 (25μM)顯著增強(qiáng)大鼠海馬腦區(qū)的LTP (Control: 143.04%±3.86%, Na2S4: 168.26%±2.70%),并逆轉(zhuǎn)LV-CBS-RNAi造成的LTP損傷(LV-CBS-RNAi: 100.05 % ±1.35%, LV-CBS-RNAi+Na2S4: 162.78%±7.17%): (10)衰老大鼠海馬腦區(qū)H2S含量下降(Adult: 100.00%±5.13%, Aged: 66.49%±1.74%)、總蛋白及SR蛋白的硫巰基化水平下調(diào)(Adult: 106.32±3.59%, Aged: 55.12%±5.78%)以及LTP損傷,外源性補(bǔ)充NariS(100μM)恢復(fù)總蛋白及SR蛋白的硫巰基化水平(Aged: 105.80%±2.13%, Aged+NailS: 283.44±38.98%), D-serine水平(Aged: 100.00%±5.14%, Aged+NariS: 235.56%±24.09%)以及LIP (Aged: 113.44%±3.50%, Aged+NariS: 153.68%±3.98%)。結(jié)論：硫巰基化信號分子H2S通過形成多硫化物硫巰基化修飾SR來增強(qiáng)其催化活性,上調(diào)其產(chǎn)物D-serine的水平,從而易化大鼠海馬腦區(qū)Sehaffer側(cè)支至CA1通路的LTP;外源性補(bǔ)充H2S恢復(fù)D-serine信號通路,能夠一定程度上逆轉(zhuǎn)衰老后D-serine缺乏導(dǎo)致的突觸可塑性損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R965

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本文編號：2056824