本文選題：Sis-25 + T細胞��； 參考：《成都醫(yī)學院》2017年碩士論文

【摘要】：免疫抑制劑在臨床上被廣泛應用于治療自身免疫性疾病及器官移植排斥反應。然而這些疾病屬于多因素誘發(fā)、多組織器官參與的復雜性疾病,患者的個體差異及藥物敏感性的不同,導致單獨使用一種免疫抑制劑,如環(huán)孢霉素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸酯、FTY720等,不能完全控制病情,還需采用聯(lián)合、輪換或序貫治療。因此,繼續(xù)尋找和開發(fā)新型免疫抑制劑將為患者提供更多的選擇。來源于天然產物的藥物治療疾病的歷史悠久,天然產物資源豐富、毒副作用小,因此將其開發(fā)成為免疫抑制劑具有十分顯著的優(yōu)勢。從帚狀香茶菜分離獲得具有新穎骨架雜二萜類化合物Scopariusicides A,發(fā)現(xiàn)Scopariusicides A可顯著抑制抗CD3/CD28抗體誘導的人T細胞增殖,提示其具有免疫抑制活性,通過對它生源關系的探討,設計并完成Scopariusicides A的仿生合成,結構修飾后得到一系列結構類似的衍生物,經免疫抑制活性篩選,我們發(fā)現(xiàn)有化合物Sis-25具有最強的免疫抑制活性。本論文從體外細胞分子水平上探索Sis-25抑制T細胞增殖的作用機制,為后續(xù)開發(fā)成為應用于臨床的新型免疫抑制劑提供理論基礎與實驗依據。目的從人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分離純化獲得T細胞,并對其進行鑒定及增殖特性研究。在此基礎上探索新型雜二萜類化合物Sis-25抑制T細胞增殖的作用機制。方法(1)采用Ficoll密度梯度離心法分離人外周血獲取外周血單個核細胞,再經免疫磁珠純化得到T細胞。(2)流式細胞術檢測細胞增殖、細胞凋亡、細胞活力、CD25和CD69表達以及細胞周期。(3)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測促性細胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ,以及抗炎細胞因子IL-10的分泌。(4)蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測GSK3β、p70S6K、Akt、STAT5和ERK1/2的蛋白表達和磷酸化。結果本研究成功分離純化獲得T細胞,并使T細胞純度達到95%以上。根據T細胞生長相對曲線可知,在72hr至96hr這一時間段是T細胞對數生長期,這一時間段可作為化合物免疫抑制活性檢測觀察最佳時間點。在此基礎上我們發(fā)現(xiàn),Sis-25可顯著抑制抗CD3/CD28抗體誘導的人T細胞增殖及混合T淋巴細胞反應,IC50分別為5.5±0.7μM和5.1±1.1μM。Sis-25對抗人CD3/CD28抗體誘導活化人T細胞發(fā)生細胞凋亡沒有影響,并且對初始靜息T細胞、IL-4處理的活化T細胞(此細胞可維持活化狀態(tài)但無增殖能力)以及靜息的PBMC無顯著細胞毒性,提示Sis-25選擇性地抑制T細胞活化增殖。Sis-25不抑制T細胞活化表面標志物CD25和CD69表達以及細胞因子IL-2分泌,提示Sis-25不作用T細胞活化階段,其抑制T細胞增殖的作用機制不同于FK506。Sis-25阻滯活化的T細胞周期于G0/G1期,且呈劑量依賴效應。Sis-25顯著抑制活化T細胞分泌炎性細胞因子IL-6,IL-17A和IFN-γ,但不影響抗炎因子IL-10的分泌。Sis-25顯著抑制IL-2誘導活化T細胞增殖(IC50:4.5±0.9μM)與p70S6K磷酸化,但不影響Akt、STAT5與ERK1/2蛋白表達及其磷酸化,并且可增強GSK3β蛋白磷酸化。結論綜上所述,Sis-25可能是通過阻斷mTOR/p70S6K信號通路達到抑制人T細胞增殖。Sis-25有望作為免疫抑制劑先導化合物,為開發(fā)治療自身免疫性疾病及器官排斥反應的新型免疫抑制劑提供前期的理論基礎與實驗依據。
[Abstract]:Immunosuppressants are widely used in the clinical treatment of autoimmune diseases and organ transplant rejection. However, these diseases are caused by multiple factors, complex diseases involving multiple organs, individual differences in patients and different drug sensitivity, resulting in the use of an immunosuppressant, such as cyclosporin, and tacrolimus alone. Rapamycin, mycophenolate mofetil, FTY720, and so on, can not completely control the disease, but also need to be combined, rotated or sequential therapy. Therefore, continuing to find and developing new immunosuppressive agents will provide more options for patients. Scopariusicides A, a novel two terpenoid compound with novel skeleton, was obtained from broom like tea. It was found that Scopariusicides A could significantly inhibit the proliferation of T cells induced by anti CD3/CD28 antibody, suggesting that it has immunosuppressive activity. The bionic synthesis of Scopariusicides A was completed. After the structural modification, a series of analogous derivatives were obtained. After screening the immunosuppressive activity, we found that compound Sis-25 had the strongest immunosuppressive activity. This paper explored the mechanism of Sis-25 inhibition of T cell proliferation from the cell molecular level in vitro, and was used for subsequent development. A new clinical immunosuppressant provides theoretical basis and experimental basis. Objective to isolate and purify T cells from human peripheral blood mononuclear cells (peripheral blood mononuclear cell (PBMC)), and to identify and proliferate properties of T cells. Based on this, a new type of hetero two terpenoids, Sis-25, is explored to inhibit the proliferation of T cells. Methods (1) Ficoll density gradient centrifugation was used to separate peripheral blood mononuclear cells from human peripheral blood and T cells were purified by immunomagnetic beads. (2) flow cytometry was used to detect cell proliferation, cell apoptosis, cell viability, CD25 and CD69 expression and cell cycle. (3) enzyme linked immunosorbent assay (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) IL-6, IL-17 and IFN- gamma, and the secretion of anti-inflammatory cytokine IL-10 were detected. (4) protein expression and phosphorylation of GSK3 beta, p70S6K, Akt, STAT5 and ERK1/2 were detected by protein immunoblotting (Western blotting). Results the T cells were isolated and purified, and the purity of the cells was above 95%. The curve shows that the time period of 72hr to 96hr is the logarithmic growth period of T cells. This time period can be used as the best time to detect the immunosuppressive activity of compounds. On this basis, we found that Sis-25 can significantly inhibit the proliferation of CD3/CD28 antibody induced human T cells and the reaction of mixed T lymphocyte, IC50 is 5.5 + 0.7 u M and 5.1 + respectively. 1.1 mu M.Sis-25 did not affect the apoptosis of activated human T cells induced by human CD3/CD28 antibody, and there was no significant cytotoxicity for the initial resting T cells, IL-4 treated activated T cells (the cells could maintain the activation state but no proliferation ability) and the resting PBMC had no significant cytotoxicity, suggesting that Sis-25 selectively inhibited the T cell activation and proliferation of.Sis-25. The expression of T cell activation surface markers, CD25 and CD69, and the secretion of cytokine IL-2, suggesting that Sis-25 does not act on the activation phase of T cells. The mechanism of its inhibition of T cell proliferation is different from that of the T cell cycle activated by FK506.Sis-25 block in G0/G1 period, and the dose dependence effect.Sis-25 significantly inhibits the activation of inflammatory cytokines secreted by the activated T cells. 6, IL-17A and IFN- gamma, but does not affect the secretion of.Sis-25 by the anti-inflammatory factor IL-10 significantly inhibits the proliferation of IL-2 induced activated T cells (IC50:4.5 + 0.9 mu M) and p70S6K phosphorylation, but does not affect the expression and phosphorylation of Akt, STAT5 and ERK1/2 protein, and can enhance the phosphorylation of the beta protein. The pathway to inhibit the proliferation of human T cells is expected to be a precursor of immunosuppressive agents. It provides the theoretical basis and experimental basis for the development of new immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune diseases and organ rejection.
【學位授予單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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