本文選題：胰島素 + 蛋白激酶C　； 參考：《浙江大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：游離脂肪酸作為人體重要的營養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)又是重要的信使物質(zhì),通過G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)起調(diào)節(jié)代謝等生理作用。最近研究表明,長鏈脂肪酸亞油酸是胰島p細(xì)胞高表達(dá)的GPR40受體的內(nèi)源性配體,可以通過GPR40呈葡萄糖依賴性的促進(jìn)胰島素合成和分泌。此外GPR40還能輔助DPP-IV抑制劑促進(jìn)胰島素的分泌。本文為了解析GPR40增強(qiáng)胰島素分泌的機(jī)制,采用cAMP響應(yīng)元件(CRE)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測到在細(xì)胞水平上游離脂肪酸和forskolin共孵育會(huì)顯著提高熒光素酶活性,其小分子激動(dòng)劑GW9508也有同樣效果,并能被特異拮抗劑GW1100抑制。此外,PDE的普遍抑制劑IBMX和兩種異構(gòu)體抑制劑MMPX,Rolipram證實(shí)了PDE1能協(xié)助亞油酸介導(dǎo)的熒光素酶活性提高,而非PDE4。進(jìn)一步的Gs小肽拮抗實(shí)驗(yàn)證實(shí)亞油酸和forskolin協(xié)同介導(dǎo)的熒光素酶活性的提高并不通過Gs蛋白,而Gq的特異性抑制劑UBO-QIC能顯著地抑制這種GPR40介導(dǎo)的CREB活性增強(qiáng)。PKC抑制劑和cAMP ELISA檢測驗(yàn)證了Gq/PKC/CREB通路而非cAMP的激活來協(xié)助cAMP/PKA通路發(fā)揮增效作用,并且PKC通過磷酸化CREB的Ser133,121位點(diǎn)來激活轉(zhuǎn)錄,8-CPT-cAMP也證實(shí)了cAMP是該通路中重要的一環(huán)。用艾塞那肽取代forskolin發(fā)現(xiàn),亞油酸同樣有協(xié)同艾塞那肽增強(qiáng)熒光素強(qiáng)度的作用,并且通過Gq/PKC/CREB信號(hào)通路來協(xié)同GLP-1R/Gs/PKA通路。將細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)在SD大鼠上重復(fù)后,發(fā)現(xiàn)亞油酸同樣協(xié)同forskolin或exentin-4來促進(jìn)胰島素的分泌,相比于單獨(dú)作用得到顯著提高。用PKC抑制劑Go6983和Gq抑制劑UBO-QIC處理后能顯著抑制胰島素的分泌,在敲除Gq亞基的小鼠上也同樣抑制了亞油酸和forskolin或exendin-4激起的胰島素分泌。因此亞油酸能協(xié)同forskolin和exentin-4促進(jìn)胰島素的分泌,隨后我們發(fā)現(xiàn)利拉魯肽側(cè)鏈帶有棕櫚酸修飾,而棕櫚酸是GPR40的內(nèi)源性配體,利拉魯肽和艾塞那肽對于激活GLP-1R具有相同的活性,將側(cè)鏈用做亞油酸修飾發(fā)現(xiàn)能激活GPR40,并也能激活GLP-1R。在同時(shí)轉(zhuǎn)染GPR40和GLP-1R的細(xì)胞株中,利拉魯肽活性提高了20%。我們的研究為有效地治療糖尿病提供了新的思路。 在穩(wěn)定表達(dá)GPR40-EGFP的HEK293細(xì)胞中,GPR40具有配體依賴型內(nèi)吞和配體不依賴型內(nèi)吞兩種方式。不僅在HEK293細(xì)胞中,在β-TC-6,GPR40內(nèi)源性細(xì)胞中過表達(dá)GPR40也發(fā)現(xiàn)有配體不依賴型內(nèi)吞的存在。用FITC-anti-Flag抗體標(biāo)記GPR40受體的實(shí)驗(yàn)表明在熒光顯微鏡下觀察到的GPR40大量聚集在胞質(zhì)內(nèi)不是由于受體高表達(dá)所致,而是由于配體不依賴型內(nèi)吞造成的。Arrestin-3和GRK2敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)配體依賴型內(nèi)吞依賴于GRK2和arrestin-3,而配體不依賴內(nèi)吞則不依賴GRKs和arrestins。此外,GPR40配體依賴型內(nèi)吞能與Rab4/Rab5共定位,而配體不依賴型內(nèi)吞及再循環(huán)則不經(jīng)過Rab4通路,而能同Rab5共定位。 由于脂肪酸家族具有高度同源性,因此該發(fā)現(xiàn)能運(yùn)用到其他脂肪酸家族成員。并且受體經(jīng)歷不同的內(nèi)吞途徑,如果能找到與配體不依賴型內(nèi)吞相關(guān)的結(jié)合蛋白,則可以用來篩選阻斷自激活內(nèi)吞行為的化合物。
[Abstract]:Free fatty acids are important nutrients and important messenger substances, which regulate metabolism through the G protein coupling receptor (GPCRs). Recent studies have shown that long chain fatty acid linoleic acid is an endogenous ligand for the high expression of GPR40 receptor in pancreatic islet P cells. It can promote the pancreas through GPR40 to promote the pancreas. In addition, GPR40 also assists the DPP-IV inhibitor to promote insulin secretion. In order to analyze the mechanism of GPR40 enhancement of insulin secretion, the cAMP response element (CRE) luciferase reporter system has detected a significant increase in luciferase activity at the upper level of cell level and forskolin, and its small molecules The agonist GW9508 also has the same effect and can be suppressed by the specific antagonist GW1100. In addition, the universal inhibitor IBMX of PDE and the two isomer inhibitor MMPX, Rolipram confirmed that PDE1 can help the linoleic acid mediated luciferase activity increase, but not PDE4. further Gs small peptide antagonistic experiments confirm the synergistic fluorescence mediated by linoleic acid and forskolin The enhancement of the activity of the enzyme does not pass through the Gs protein, and the specific inhibitor UBO-QIC of Gq can significantly inhibit the GPR40 mediated CREB activity and enhance the.PKC inhibitor and cAMP ELISA detection to verify the Gq/PKC/CREB pathway rather than cAMP activation to assist the cAMP/PKA pathway to exert synergism, and PKC through the phosphorylation of the locus. Activation of transcription, 8-CPT-cAMP also confirmed that cAMP is an important link in the pathway. Using erisannin instead of forskolin, it is also found that linoleic acid also synergistically enhances fluorescein intensity with the synergistic effect of the Gq/PKC/CREB signaling pathway to the GLP-1R/Gs/PKA pathway. The cell level experiment was repeated on SD rats and the oil Suboil was found. The acid also synergies with forskolin or exentin-4 to promote insulin secretion, which is significantly increased compared to the individual effect. The secretion of insulin can be inhibited significantly with the PKC inhibitor Go6983 and the Gq inhibitor UBO-QIC. The insulin secretion induced by linoleic acid and forskolin or exendin-4 is also inhibited in the mice that knock off the Gq subunit. This linoleic acid can promote the secretion of insulin with forskolin and exentin-4. Then we found that the Liraru peptide side chain is modified with palmitic acid, and palmitic acid is an endogenous ligand for GPR40. The Liraru peptide and erenin have the same activity for activating GLP-1R. The side chain is used as linoleic acid modification to activate GPR40 and also activate GL. P-1R. in the cells transfected with GPR40 and GLP-1R simultaneously, the activity of the L La r peptide increased by 20%.. Our research provides a new way of thinking for the effective treatment of diabetes.
In HEK293 cells that stably express GPR40-EGFP, GPR40 has two ways of ligand dependent endocytosis and ligand endocytosis. Not only in HEK293 cells, the presence of GPR40 in beta -TC-6 and GPR40 endogenous cells is also found in the presence of ligands without dependent endocytosis. The experiment of labeling GPR40 receptors with FITC-anti-Flag antibodies indicates that the fluorescence is in the presence of fluorescence. The massive aggregation of GPR40 observed under the microscope is not due to the high expression of the receptor, but the.Arrestin-3 and GRK2 knockout experiments caused by the ligand undependent endocytosis found that the ligand dependent endocytosis depends on the GRK2 and arrestin-3, while the ligand does not depend on the endocytosis in addition to the GRKs and arrestins., and the GPR40 ligand dependent type. TAC can co locate with Rab4/Rab5, while ligand independent endocytosis and recycling can co locate with Rab5 without Rab4 pathway.
Because the fatty acid family is highly homologous, the discovery can be applied to other fatty acid family members. And the receptors experience different endocytic pathways, and if they can find binding proteins associated with the ligand without endocytosis, they can be used to screen the compounds that block self activated endocytosis.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R965

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2014919