本文選題：小干擾RNA + 細(xì)胞穿膜肽��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:近年來,RNA干擾在基因功能和基因治療方面的研究較為廣泛,已逐漸發(fā)展為一種較成熟的技術(shù)。RNA干擾是一種特異性細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄機(jī)制,通過誘發(fā)相應(yīng)mRNA的酶降解發(fā)揮基因沉默作用。雙鏈小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)是RNA干擾的效應(yīng)分子之一,理論上可抑制任何靶基因表達(dá),已被列為基因型疾病的潛在治療劑。但是,裸露的siRNA進(jìn)入血清易被核酸酶降解,且siRNA帶負(fù)電荷,親水性強(qiáng),導(dǎo)致其不易透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮高效的RNAi作用。因此,siRNA應(yīng)用的關(guān)鍵在于尋找安全、有效的遞送載體。目前已有很多載體用于改善siRNA的核酸酶抗性而又不干擾其沉默效率。其中,細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)作為基因遞送載體被廣泛研究且表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢。細(xì)胞穿膜肽通常由5~30個氨基酸構(gòu)成,是一類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的陽離子或兩親性短肽。它可將不同的貨物分子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞和組織中而不引起顯著毒副作用。本文擬構(gòu)建一種可以包載核酸類藥物siRNA并提高其轉(zhuǎn)染效果的納米復(fù)合物。首先選取細(xì)胞穿膜肽中的八聚精氨酸(R8)作為siRNA的基本載體,采用硬脂酸和聚乙二醇對其進(jìn)行修飾,合成出幾種載體材料。再將載體材料與siRNA孵育制備成納米復(fù)合物。然后,通過納米粒度和zeta電位分析儀及瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)考察納米復(fù)合物的理化性質(zhì)和包載能力,從而篩選出能夠縮合并遞送siRNA入胞的復(fù)合物。最后,以MCF-7、A549為模型細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞攝取試驗(yàn),通過與市售產(chǎn)品(Lipofectamine2000)作比較,考察自制復(fù)合物介導(dǎo)siRNA入胞的效果。方法:1載體合成:首先,合成SA-R8。先制備SA活化反應(yīng)液,再取SA活化液加入到R8溶液中反應(yīng)30min,然后將反應(yīng)液以純凈水為透析液透析24 h,透析結(jié)束后取少量透析液進(jìn)行質(zhì)譜分析。接著,用合成的SA-R8與mPEG2000-Mal和mPEG5000-Mal反應(yīng)合成SA-R8-PEG,同樣將反應(yīng)液以純凈水為透析液透析純化,然后取適量透析液質(zhì)譜檢測。2復(fù)合物制備及評價(jià):合成的載體材料具備兩親性,在極性溶劑中能自組裝成納米粒;八聚精氨酸(r8)帶正電荷,可通過靜電相互作用縮合帶負(fù)電荷的sirna�；谝陨显�,首先,用depc水溶解載體材料使自組裝成空白納米粒,隨后加入藥物sirna渦旋靜置,制備載sirna的納米復(fù)合物。然后,通過納米粒度和zeta電位分析儀對復(fù)合物的粒徑、電位進(jìn)行測定。接著,通過瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)對復(fù)合物包載sirna的能力進(jìn)行考察。根據(jù)考察結(jié)果,篩選出粒徑、電位合適且能夠完全包載sirna的復(fù)合物。最后,以mcf-7和a549兩種細(xì)胞為模型細(xì)胞,將篩選出的最佳復(fù)合物與游離sirna和市售產(chǎn)品(lipofectamine2000)一同給藥進(jìn)行細(xì)胞攝取試驗(yàn),通過流式細(xì)胞分析儀定量檢測及評價(jià)自制復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果:質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示,合成的sa-r8、sa-r8-peg2000和sa-r8-peg5000實(shí)際分子量與理論值一致或相近;復(fù)合物(sa-r8/sa-r8-peg200020%)/sirna的平均粒徑在300~400nm之間,復(fù)合物(sa-r8/sa-r8-peg500020%)/sirna平均粒徑在500~800nm之間,隨著n/p比的增大,兩者zeta電位從負(fù)變?yōu)檎?瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)顯示,兩種復(fù)合物(sa-r8/sa-r8-peg200020%)/sirna和(sa-r8/sa-r8-peg500020%)/sirna均在n/p比為20:1時(shí)完全包載sirna;細(xì)胞攝取試驗(yàn)分析顯示兩種納米復(fù)合物能夠成功地將sirna轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞;且自制載體sr/srp2k介導(dǎo)sirna轉(zhuǎn)染細(xì)胞能力與市售產(chǎn)品(lipofectamine2000)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:1本文成功合成了載體材料sa-r8-peg2000和sa-r8-peg5000,且方法簡便易行,重現(xiàn)性較好。2通過靜電相互作用成功制備了載sirna的納米復(fù)合物,且方法操作簡便,重現(xiàn)性較好。通過粒徑、電位的測定及凝膠電泳試驗(yàn)證明復(fù)合物能夠成功包載模型藥物sirna。3細(xì)胞攝取試驗(yàn)表明,相比游離sirna,當(dāng)n/p為20:1時(shí),兩種復(fù)合物(sa-r8/sa-r8-peg200020%)/sirna和(sa-r8/sa-r8-peg500020%)/siRNA明顯提高了siRNA的細(xì)胞攝取;且自制載體SR/SRP2K(載體SA-R8/SA-R8-PEG200020%的縮寫)的siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果達(dá)到市售產(chǎn)品(Lipofectamine 2000)水平。今后將繼續(xù)對該遞藥系統(tǒng)的處方、工藝進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)一步提高其轉(zhuǎn)染效率,以期為腫瘤治療提供新的方法。
[Abstract]:In recent years , RNA interference has been widely studied in gene therapy and gene therapy , and it has been developed into a more mature technology . The particle size and potential of the complexes were determined by using nano - particle size and zeta potential analyzer .
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R943

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳中華;朱德生;李軍;黃展勤;;非病毒siRNA載體研究進(jìn)展[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2015年07期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李玉環(huán);靶向survivin的siRNA及其改性穿膜肽納米給藥系統(tǒng)的研究[D];吉林大學(xué);2016年

，

本文編號：2014465