發(fā)布時(shí)間：2018-06-09 14:23

  本文選題：SansalvamideA + B16　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：腫瘤的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重危脅人類健康。目前，藥物抗腫瘤治療療效仍不理想，主要原因在于傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物在殺傷患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，其巨大的毒副作用不可避免。因此，尋找新型高效且低毒的抗腫瘤藥物是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重大課題。天然產(chǎn)物化學(xué)研究一直是制藥業(yè)新藥研制的重要途徑和主要來(lái)源，天然產(chǎn)物成分具有結(jié)構(gòu)新穎、療效高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，所以目前天然產(chǎn)物化學(xué)及其研究成果已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥業(yè)。 Sansalvamide A是1999年被報(bào)道的從海洋真菌中分離出的一種天然環(huán)五肽酯，具有很高的親脂性及顯著的抗腫瘤能力。Sansalvamide A環(huán)肽是由Sansalvamide A改造所得到的一類化合物。經(jīng)過(guò)多年的研究，新報(bào)道的Sansalvamide A環(huán)肽具有200余種，其中很多衍生物的活性明顯提高。在本課題中，由河北科技大學(xué)藥用分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供了9種新合成Sansalvamide A環(huán)肽衍生物，選取小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞，人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞三種細(xì)胞模型做體外抗腫瘤活性研究，觀察這9種新化合物的抗腫瘤活性。同時(shí)，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原代培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞和SD大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，用于研究9種新化合物對(duì)這兩種正常細(xì)胞模型生長(zhǎng)的抑制作用。通過(guò)抗腫瘤活性篩選，選擇活性較好的化合物5（H-10）和化合物9（H-15）為研究重點(diǎn)，用小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞為模型，對(duì)化合物H-10和化合物H-15抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制做進(jìn)一步研究。 具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：第一部分Sansalvamide A環(huán)肽衍生物抗腫瘤活性及對(duì)正常細(xì)胞毒性的研 究 目的：9種新型SansalvamideA環(huán)肽衍生物抗腫瘤活性篩選及其對(duì)正常細(xì)胞毒性的研究。 方法：應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞，人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，做為腫瘤細(xì)胞模型用于9種新型SansalvamideA環(huán)肽衍生物抗腫瘤活性篩選。原代培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞和SD大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，用于研究9種新化合物對(duì)這兩種正常細(xì)胞模型生長(zhǎng)的抑制作用。磺酰羅丹明B（SRB）比色分析法分析結(jié)果。到置相差顯微鏡觀察化合物作用不同時(shí)間后B16細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和大鼠平滑肌細(xì)胞（VSMC）形態(tài)，數(shù)量及生長(zhǎng)狀態(tài)的變化情況。 結(jié)果： 19種Sansalvamide A環(huán)肽衍生物對(duì)小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞，人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖具有抑制作用，用SRB比色法測(cè)定空白組以及1%DMSO組48h后吸光度（OD）值，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)1%DMSO（溶解化合物溶劑的最大量）對(duì)B16，MCF-7和MDA-MB-231三種細(xì)胞的增殖無(wú)影響，P0.05。除化合物6，8和9在50μM對(duì)MDA-MB-231增殖無(wú)抑制作用外，9種化合物對(duì)這三種細(xì)胞都顯示出了抗腫瘤活性。對(duì)于B16細(xì)胞，化合物2，5和6抑制率最強(qiáng)，分別為82.43%，81.79%和83.19%；對(duì)于MCF-7細(xì)胞，抑制率最強(qiáng)的三種化合物分別為化合物5，，64.19%，化合物9，51.08%和化合物4，50.89%；對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞，化合物4和5作用最強(qiáng)，抑制率分別為68.04%和66.56%。 29種化合物對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞和SD大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用。 3化合物H-10可使B16細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和分化的形態(tài)學(xué)改變；化合物H-15可使B16細(xì)胞出現(xiàn)明顯的分化形態(tài)改變。 結(jié)論：9種SansalvamideA環(huán)肽衍生物具有抗腫瘤活性且對(duì)正常細(xì)胞毒性較�。换衔颒-10對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有活性，考慮具有誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的作用；化合物H-15可能通過(guò)誘導(dǎo)B16細(xì)胞分化抑制其增殖。 第二部分新型環(huán)五肽H-10抑制B16細(xì)胞增殖機(jī)制的研究 目的：研究化合物H-10抑制B16細(xì)胞增殖的機(jī)制。 方法：磺酰羅丹明B比色分析法研究化合物H-10抑制B16細(xì)胞增殖的濃度依賴性，細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長(zhǎng)曲線研究化合物H-10抑制B16增殖的時(shí)間依賴性。流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析B16細(xì)胞經(jīng)化合物H-10作用后凋亡細(xì)胞DNA含量。Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3，caspase-8和caspase-9表達(dá)的情況。 結(jié)果： 1化合物H-10抑制B16細(xì)胞生長(zhǎng)具有濃度依賴性：1%DMSO組與空白組相比，增殖率無(wú)明顯變化，P0.05。經(jīng)不同濃度化合物H-10（0.1、1、10、50和100μM）處理48h后，B16細(xì)胞增殖率逐漸降低。與對(duì)照組相比，100μM組P0.01，50μM組P0.01，10μM組P0.05，其增值率均明顯降低。同時(shí)在光學(xué)顯微鏡下可以明顯觀察到B16經(jīng)化合物H-10作用后呈現(xiàn)的凋亡形態(tài)。經(jīng)公式計(jì)算得到化合物H-10作用B16細(xì)胞48h的IC50（半抑制濃度）為39.68μM。 2化合物H-10抑制B16細(xì)胞生長(zhǎng)具有時(shí)間依賴性：經(jīng)濃度為50μM的化合物H-10作用B16細(xì)胞24h、48h、72h、96h、120h和144h后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。 3化合物H-10具有誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的作用：流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示，經(jīng)濃度為50μM的化合物H-10作用B16細(xì)胞24h后，出現(xiàn)明顯DNA亞二倍體峰，凋亡細(xì)胞比例為(9.21±4.62)%，與對(duì)照組凋亡比例(0.96±0.22)%相比，P0.05，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blot結(jié)果顯示，經(jīng)10、30和50μM化合物H-10作用后，caspase-3隨藥物濃度升高其表達(dá)量上升。 4化合物H-10誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡通過(guò)線粒體途徑：經(jīng)10、30和50μM化合物H-10作用后，通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的caspase-9隨藥物濃度升高其表達(dá)量上升，而與外源性凋亡相關(guān)的caspase-8沒(méi)有明顯變化。 結(jié)論：化合物H-10對(duì)B16細(xì)胞的增殖具有很強(qiáng)的抑制作用，且作用效應(yīng)具有顯著的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。化合物H-10作用B16細(xì)胞48h的IC50為39.68μM。化合物H-10具有誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的作用，化合物H-10誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡通過(guò)線粒體途徑。 第三部分新型環(huán)五肽H-15抑制B16細(xì)胞增殖機(jī)制的研究 目的：研究化合物H-15抑制B16細(xì)胞增殖的機(jī)制。 方法：磺酰羅丹明B比色分析法研究化合物H-15抑制B16細(xì)胞增殖的濃度依賴性，細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長(zhǎng)曲線研究化合物H-15抑制B16增殖的時(shí)間依賴性。檢測(cè)B16細(xì)胞經(jīng)化合物H-15作用后黑色素分泌量的變化。RT-PCR檢測(cè)B16細(xì)胞經(jīng)化合物H-15作用后干細(xì)胞基因Foxd3，Klf4，Sox2和Nanog的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)酪氨酸酶，Sox2和Foxd3表達(dá)的情況。 結(jié)果： 1化合物H-15抑制B16細(xì)胞生長(zhǎng)具有濃度依賴性：1%DMSO組與空白組相比，增殖率無(wú)明顯變化，P0.05。經(jīng)不同濃度化合物H-15（0.1、1、10、50和100μM）處理48h后，B16細(xì)胞增殖率逐漸降低�；衔颒-15作用B16細(xì)胞與對(duì)照組相比，50μM組和10μM組P0.01，其增值率均明顯降低。經(jīng)公式計(jì)算得到化合物H-15作用B16細(xì)胞48h的IC50為69.44μM。 2化合物H-15抑制B16細(xì)胞生長(zhǎng)具有時(shí)間依賴性：經(jīng)濃度為50μM的化合物H-15作用B16細(xì)胞24h、48h、72h、96h、120h和144h后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。 350μM化合物H-15作用B16細(xì)胞48h后細(xì)胞黑色素含量較對(duì)照組增高：經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定50μM化合物H-15作用B16細(xì)胞48h后吸光度值為0.1743±0.0227，對(duì)照組吸光度值為0.0788±0.0039，兩組間比較P0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明經(jīng)化合物H-15作用后的B16細(xì)胞分泌黑色素含量明顯增加。 450μM化合物H-15作用B16細(xì)胞48h后酪氨酸酶（TYR）的表達(dá)增加：經(jīng)濃度為50μM的化合物H-15作用B16細(xì)胞48后，酪氨酸酶（TYR）的表達(dá)較空白組增高。 5化合物H-15具有抑制Sox2, Foxd3基因表達(dá)的作用：RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)10、30和50μM化合物H-15作用24h后，Sox2和Foxd3的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，Klf4的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，Nanog的表達(dá)沒(méi)有規(guī)律性。Western-blot結(jié)果顯示，經(jīng)10、30和50μM化合物H-15作用24h后，Sox2和Foxd3的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明化合物H-15具有抑制B16細(xì)胞干細(xì)胞特性的作用。 結(jié)論：化合物H-15對(duì)B16細(xì)胞的增殖具抑制作用，且作用效應(yīng)具有顯著的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。化合物H-15作用B16細(xì)胞48h的IC50為69.44μM。化合物H-15具有誘導(dǎo)B16細(xì)胞分化的作用，經(jīng)化合物H-15作用過(guò)的B16細(xì)胞分泌黑色素的能力增強(qiáng)�；衔颒-15抑制了B16細(xì)胞Sox2和Foxd3的表達(dá)，使其腫瘤干細(xì)胞的特性受到抑制。
[Abstract]:The incidence and mortality of tumor are increasing year by year, which seriously threaten human health. At present, the effect of antitumor therapy is still not ideal, the main reason is that the traditional antitumor drugs are killing the tumor cells in the body of the patients, and their huge toxic and side effects can not be avoided. Therefore, to find a new and highly effective and low toxic antitumor drug. The chemical research of natural products has always been an important way and main source for the development of new drugs in the pharmaceutical industry. The natural product composition has the advantages of novel structure, high curative effect and small side effect. So the natural product chemistry and its research results have been widely used in the medicine industry at present.
Sansalvamide A is a kind of natural ring five peptide isolated from marine fungi reported in 1999. It has high lipophilicity and significant antitumor ability,.Sansalvamide A cyclic peptide is a kind of compound obtained by Sansalvamide A transformation. After years of research, more than 200 species of Sansalvamide A cyclones have been reported, many of which have been reported. In this subject, 9 new synthetic Sansalvamide A cyclic peptide derivatives were provided by the Key Laboratory of pharmaceutical molecular chemistry of Hebei University Of Science and Technology, and the anti tumor activity of three cell models of human breast cancer B16 cells, human breast cancer MCF-7 cells and human breast cancer MDA-MB-231 cells was studied in vitro. To investigate the antitumor activity of the 9 new compounds, the primary culture of human peripheral blood lymphocytes and SD rat aortic vascular smooth muscle cells was used to study the inhibitory effects of 9 new compounds on the growth of the two normal cell models. By screening the antitumor activity, the active compounds 5 (H-10) were selected. Compound 9 (H-15) is the focus of the study. A mouse malignant melanoma B16 cell is used as a model to further study the mechanism of compound H-10 and compound H-15 to inhibit the proliferation of tumor cells.
The research contents and results are as follows: Part One: the antitumor activity and cytotoxicity of Sansalvamide A cyclic peptide derivatives
investigate
Objective: To study the screening of 9 new SansalvamideA cyclic peptide derivatives and their cytotoxicity to normal cells.
Methods: the mouse malignant melanoma B16 cells, human breast cancer MCF-7 cells and human breast cancer MDA-MB-231 cells were cultured with cell culture technique. The tumor cell model was used as the tumor cell model for screening the anti-tumor activity of 9 new SansalvamideA cyclic peptide derivatives. The primary culture of human peripheral blood lymphatic cells and the vascular smooth muscle cells of the aorta of SD rats were used. The inhibitory effects of 9 new compounds on the growth of these two normal cell models were investigated. The results of sulfonyl Luo Danming B (SRB) colorimetric analysis were used to observe the changes in the morphology, quantity and growth state of B16 cells, lymphocytes and rat smooth muscle cells (VSMC) after the phase contrast microscope.
Result錛

本文編號(hào)：2000032