本文選題：Tat + PTD�。� 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：視網膜和脈絡膜中血管畸形增生是很多疾病導致失明的主要原因,例如糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)、老年性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)、早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity,RP)以及視網膜中央和分支靜脈阻塞等疾病。對于眼底新生血管疾病目前臨床上應用較為廣泛的治療方法包括激光光凝法、玻璃體切除術和藥物治療3種方法。其中,藥物治療應用最為廣泛,但由于眼睛存在多種生物膜屏障,使得大分子藥物在局部滴眼給藥后難以跨膜進入眼底病變處發(fā)揮作用,只能通過玻璃體注射的方式進行給藥,玻璃體注射往往會給患者帶來不可逆的損傷。因此,尋找一種安全、有效、操作簡便的治療方法顯得尤為重要。內皮抑素(endostatin, Es)作為一種內源性新生血管抑制劑具有較好的臨床應用前景,它不僅可以應用于腫瘤的治療,而且在抗眼底新生血管疾病方面也發(fā)揮著重要作用。但是,Es不能自主穿透眼球屏障到達眼底病變處發(fā)揮作用,只能選用傳統(tǒng)的玻璃體注射進行給藥,同樣會給患者帶來極大的痛苦與不便。為了使Es能夠自主到達眼底,本課題組已證明將具有穿透細胞膜能力的人類1型免疫缺陷病毒HIV反式激活因子的蛋白轉導域(protein transduction domain of the transacting activator of transcription, Tat PTD)與Es融合表達后得到的重組蛋白Tat PTD-Es能夠到達眼底。但是,由于Tat PTD的穿膜能力較強,使得目標分子的分布不可控,導致目標分子不能大量富集于病灶處發(fā)揮作用,因此需要對Tat PTD-Es進行進一步改造。整合素αvβ3在新生血管的內皮細胞處高表達,并且具有三肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)的特異性結合位點,因此RGD對新生血管的內皮細胞具有靶向性。故本課題利用基因工程的方法,將穿膜肽Tat PTD和靶向肽RGD分別融合到Es的N端和C端表達得到重組蛋白Tat PTD-Es-RGD,以期望其能夠自主穿透眼球屏障并能靶向治療眼底新生血管疾病。本課題的研究內容及結果有以下幾個方面：(1) Tat PTD-Es-RGD在大腸桿菌中的表達選取pET28a(+)作為表達質粒,構建重組質粒pET28a(+)-Es、pET28a(+)-Tat PTD-Es、pET28a(+)-Es-RGD和pET28a(+)-Tat PTD-Es-RGD,轉化入E.coli Origami2 (DE3)進行表達,其中表達出的Es和Tat PTD-Es不帶有任何標簽,而Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD帶有純化標簽6×His-tag。利用Ni2+-Sepharose親和層析純化Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD,利用Heparin-Sepharose親和層析純化Es和Tat PTD-Es,所得產品再經Sephadex G-50進行進一步純化。為了提高產量,考慮從包涵體中獲得目的蛋白。摸索包涵體的洗滌條件,采用稀釋法復性包涵體蛋白,考察不同GSSG/GSH對復性效率的影響,最后經親和層析和Sephdex G-50從復性液中純化出目的蛋白。結果表明,獲得可溶性表達的條件如下：Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD為25℃誘導16h,Tat PTD-Es為37℃C誘導4h；而4種重組蛋白以包涵體形式表達的條件均為37℃誘導4h。3L發(fā)酵產物的裂解液上清可分別得到0.5 mg、4.2mg、3.4 mg和3.2 mg的Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD。對于包涵體的復性,Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD復性效率達到最高時,GSSG/GSH分別為1:1、1:1、0.2：1和0.8：1。對于3 L的發(fā)酵產物,從包涵體中純化得到的重組蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD的產量分別為5.8 mg、9.6 mg、18.9 mg和15.1 mg,純度分別為90.1%、85.6%、80.6%和90.3%。(2) Tat PTD-Es-RGD的體外活性及體外穿透眼球屏障的能力采用CCK-8法測定從包涵體蛋白中分離純化得到的重組蛋白Es、Tat PTD-Es、 Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD對人臍靜脈內皮細胞EAHY926增殖的抑制作用；利用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型評價重組蛋白對CAM血管生成的抑制作用；用劃痕實驗考察重組蛋白對內皮細胞EAHY926遷移的抑制作用；利用體外血管生成實驗考察重組蛋白對內皮細胞EAHY926血管生成的抑制作用。結果表明,4種重組蛋白均能抑制內皮細胞EAHY926的增殖,并具有劑量依賴性,在濃度為8 μmo/L時4種蛋白的抑制率均能達到80%左右；在CAM模型中,4種重組蛋白均能抑制由bFGF誘導的血管生成,與bFGF組相比Tat PTD-Es-RGD可以使血管面積由(38.4±3.2)%降低到(17.9±2.5)%,并且與Es組相比,其它3種重組蛋白對CAM血管生成的抑制作用均無顯著性差異；劃痕實驗結果表明,重組蛋白Tat PTD-Es-RGD在24 h能抑制(54.92±3.36)%的內皮細胞EAHY926遷移,在48 h仍能抑制(42.30±7.92)%的細胞遷移,4種重組蛋白對內皮細胞遷移的抑制作用相似；Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD能夠顯著地抑制管狀結構的形成,與對照組相比其抑制率分別為(60.77±8.42)%、(60.30±8.41)%、(64.89±6.38)%和(61.70±6.38)%。結果表明,在Es的N端和C端分別引入Tat PTD和RGD后,并沒有對Es的活性產生顯著性影響。采用air-lifting多層培養(yǎng)大鼠角膜上皮細胞(rat corneal epithelial cell, RCEC)構建體外角膜屏障,采用大鼠視網膜微血管內皮細胞(rat retinal microvascular endothelial cell, RMEC)和大鼠視網膜微血管周細胞(rat retina microvascular pericytes, RRPC)共培養(yǎng)的方法構建體外血-視網膜屏障(blood retina barrier,BRB)；通過測定跨膜電阻(Trans-epithelial electrical resistance, TEER)值和熒光素鈉(Na-F)滲透率對上述兩種屏障的性能進行評價；用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記目的蛋白,通過熒光酶標儀來測定穿透屏障的重組蛋白濃度從而判定不同重組蛋白的穿膜能力；利用S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine, SNAP)上調BRB共培養(yǎng)物中RMEC表面整合素αvβ3的表達量,考察FITC標記的Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD的穿膜能力,間接反應兩種重組蛋白與RMEC表面整合素αvβ3的結合能力。結果表明,采用上述方法建立的體外角膜屏障和BRB均具有較好的生物膜屏障的特性；對于角膜屏障,與Es相比,Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD組均在下室中檢測到較高的熒光強度,且具有顯著性差異,而Es-RGD沒有顯著性差異,這表明Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD具有較強的穿透角膜屏障的能力；BRB模型中檢測到與角膜屏障相似的結果,表明相對于Es而言,Tat PTD-Es和TatPTD-Es-RGD同樣具有較強的穿透BRB的能力；與未加入SNAP刺激的BRB模型相比,Tat PTD-Es-RGD的穿膜能力顯著性地降低,而Tat PTD-Es并未與之前表現(xiàn)出顯著性差異,由此可以間接證明Tat PTD-Es-RGD與RMEC表面的整合素αvβ3具有較高的親和性。(3) Tat PTD-Es-RGD眼部藥代動力學及藥效學研究對重組蛋白的眼部藥代動力學進行研究,考察4種重組蛋白在滴眼給藥后能否到達視網膜及在視網膜的代謝情況。結果顯示Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD在視網膜中的最高濃度(Cmax值)分別為(8.43±0.85)ng/mg和(9.42±0.77)ng/mg,與Es最高濃度(0.68±0.10)ng/mg相比,顯著性升高。Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD在視網膜中的半衰期(T1/2)分別為(9.64±1.31)h和(11.03±1.95)h,另外兩種蛋白質的半衰期沒有統(tǒng)計學差異。表明帶有Tat PTD的重組蛋白能夠通過局部滴眼到達眼底,而且Tat PTD-Es-RGD的濃度相對較高。建立氧誘導視網膜病變(oxygen-induced retinopathy, OIR)模型,通過滴眼給藥后,對4種重組蛋白的藥效學進行評價。視網膜鋪片結果表明,與負對照組相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼組的無灌注區(qū)面積和新生血管簇面積顯著性降低,且Tat PTD-Es-RGD滴眼組的效果要顯著優(yōu)于Tat PTD-Es;HE染色結果說明,與負對照組相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼組突破視網膜內界膜的細胞核數顯著性地降低,且Tat PTD-Es-RGD滴眼組更低；免疫組化結果顯示,與負對照組相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼能夠顯著性地抑制VEGF在視網膜處的表達,且外源性Es的染色結果顯示,這兩種重組蛋白通過滴眼給藥的方式能夠到達視網膜。以上結果證明,Tat PTD-Es-RGD和TatPTD-Es均能夠通過局部滴眼的給藥方式到達視網膜并發(fā)揮抑制新生血管生成的活性,且由于靶向肽RGD的引入使得Tat PTD-Es-RGD的效果要優(yōu)于Tat PTD-Es。(4) Tat PTD-Es-RGD抗腫瘤轉移活性的研究建立黑色素瘤B16-F10人工肺轉移模型,考察重組蛋白對腫瘤轉移的抑制作用。結果顯示,造模后腹腔注射不同重組蛋白(20 mg/kg)14 d,均能顯著性降低小鼠肺表面的腫瘤結節(jié)數,且Tat PTD-Es-RGD組的結節(jié)數要顯著地低于其它3種重組蛋白組；HE染色結果表明給藥組的肺組織腫瘤結節(jié)面積明顯降低,細胞核異性數明顯減少,并少見炎癥細胞浸潤,其中Tat PTD-Es-RGD組的腫瘤結節(jié)的面積最小。免疫組化結果顯示,4種重組蛋白均能顯著性地抑制CD34的表達,CD34+微血管面積與陰性對照組相比顯著性降低,其中在Tat PTD-Es-RGD組中達到最低。這表明,重組蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均具有較好的抗腫瘤轉移的活性,其中Tat PTD-Es-RGD的活性要顯著高于其它3種重組蛋白。本研究取得的成果和結論：(1)首次構建出大腸桿菌表達菌株pET28a(+)-Tat PTD-Es-RGD,并成功獲得純度較高的重組蛋白。(2)重組蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均能在體外抑制內皮細胞的增殖、遷移、血管生成及CAM血管生成,并表現(xiàn)出較好的體外活性。(3) Tat PTD能夠攜帶Es穿透體外角膜屏障和BRB,而Tat PTD-Es-RGD與RMEC表面整合素αvβ3分子具有較高的親和性。(4)重組蛋白Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD能夠通過局部滴眼到達視網膜并發(fā)揮較好的藥效,并且Tat PTD-Es-RGD的藥效要優(yōu)于Tat PTD-Es。(5)重組蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均具有較好的抗腫瘤轉移的活性,其中Tat PTD-Es-RGD的活性要顯著高于其它3種重組蛋白。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R943

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本文編號：1931824