本文選題：Tat + PTD　； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中血管畸形增生是很多疾病導(dǎo)致失明的主要原因,例如糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)、老年性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,RP)以及視網(wǎng)膜中央和分支靜脈阻塞等疾病。對于眼底新生血管疾病目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的治療方法包括激光光凝法、玻璃體切除術(shù)和藥物治療3種方法。其中,藥物治療應(yīng)用最為廣泛,但由于眼睛存在多種生物膜屏障,使得大分子藥物在局部滴眼給藥后難以跨膜進(jìn)入眼底病變處發(fā)揮作用,只能通過玻璃體注射的方式進(jìn)行給藥,玻璃體注射往往會給患者帶來不可逆的損傷。因此,尋找一種安全、有效、操作簡便的治療方法顯得尤為重要。內(nèi)皮抑素(endostatin, Es)作為一種內(nèi)源性新生血管抑制劑具有較好的臨床應(yīng)用前景,它不僅可以應(yīng)用于腫瘤的治療,而且在抗眼底新生血管疾病方面也發(fā)揮著重要作用。但是,Es不能自主穿透眼球屏障到達(dá)眼底病變處發(fā)揮作用,只能選用傳統(tǒng)的玻璃體注射進(jìn)行給藥,同樣會給患者帶來極大的痛苦與不便。為了使Es能夠自主到達(dá)眼底,本課題組已證明將具有穿透細(xì)胞膜能力的人類1型免疫缺陷病毒HIV反式激活因子的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain of the transacting activator of transcription, Tat PTD)與Es融合表達(dá)后得到的重組蛋白Tat PTD-Es能夠到達(dá)眼底。但是,由于Tat PTD的穿膜能力較強(qiáng),使得目標(biāo)分子的分布不可控,導(dǎo)致目標(biāo)分子不能大量富集于病灶處發(fā)揮作用,因此需要對Tat PTD-Es進(jìn)行進(jìn)一步改造。整合素αvβ3在新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞處高表達(dá),并且具有三肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)的特異性結(jié)合位點(diǎn),因此RGD對新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞具有靶向性。故本課題利用基因工程的方法,將穿膜肽Tat PTD和靶向肽RGD分別融合到Es的N端和C端表達(dá)得到重組蛋白Tat PTD-Es-RGD,以期望其能夠自主穿透眼球屏障并能靶向治療眼底新生血管疾病。本課題的研究內(nèi)容及結(jié)果有以下幾個方面：(1) Tat PTD-Es-RGD在大腸桿菌中的表達(dá)選取pET28a(+)作為表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)-Es、pET28a(+)-Tat PTD-Es、pET28a(+)-Es-RGD和pET28a(+)-Tat PTD-Es-RGD,轉(zhuǎn)化入E.coli Origami2 (DE3)進(jìn)行表達(dá),其中表達(dá)出的Es和Tat PTD-Es不帶有任何標(biāo)簽,而Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD帶有純化標(biāo)簽6×His-tag。利用Ni2+-Sepharose親和層析純化Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD,利用Heparin-Sepharose親和層析純化Es和Tat PTD-Es,所得產(chǎn)品再經(jīng)Sephadex G-50進(jìn)行進(jìn)一步純化。為了提高產(chǎn)量,考慮從包涵體中獲得目的蛋白。摸索包涵體的洗滌條件,采用稀釋法復(fù)性包涵體蛋白,考察不同GSSG/GSH對復(fù)性效率的影響,最后經(jīng)親和層析和Sephdex G-50從復(fù)性液中純化出目的蛋白。結(jié)果表明,獲得可溶性表達(dá)的條件如下：Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD為25℃誘導(dǎo)16h,Tat PTD-Es為37℃C誘導(dǎo)4h；而4種重組蛋白以包涵體形式表達(dá)的條件均為37℃誘導(dǎo)4h。3L發(fā)酵產(chǎn)物的裂解液上清可分別得到0.5 mg、4.2mg、3.4 mg和3.2 mg的Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD。對于包涵體的復(fù)性,Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD復(fù)性效率達(dá)到最高時,GSSG/GSH分別為1:1、1:1、0.2：1和0.8：1。對于3 L的發(fā)酵產(chǎn)物,從包涵體中純化得到的重組蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD的產(chǎn)量分別為5.8 mg、9.6 mg、18.9 mg和15.1 mg,純度分別為90.1%、85.6%、80.6%和90.3%。(2) Tat PTD-Es-RGD的體外活性及體外穿透眼球屏障的能力采用CCK-8法測定從包涵體蛋白中分離純化得到的重組蛋白Es、Tat PTD-Es、 Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EAHY926增殖的抑制作用；利用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型評價重組蛋白對CAM血管生成的抑制作用；用劃痕實(shí)驗(yàn)考察重組蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞EAHY926遷移的抑制作用；利用體外血管生成實(shí)驗(yàn)考察重組蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞EAHY926血管生成的抑制作用。結(jié)果表明,4種重組蛋白均能抑制內(nèi)皮細(xì)胞EAHY926的增殖,并具有劑量依賴性,在濃度為8 μmo/L時4種蛋白的抑制率均能達(dá)到80%左右；在CAM模型中,4種重組蛋白均能抑制由bFGF誘導(dǎo)的血管生成,與bFGF組相比Tat PTD-Es-RGD可以使血管面積由(38.4±3.2)%降低到(17.9±2.5)%,并且與Es組相比,其它3種重組蛋白對CAM血管生成的抑制作用均無顯著性差異；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組蛋白Tat PTD-Es-RGD在24 h能抑制(54.92±3.36)%的內(nèi)皮細(xì)胞EAHY926遷移,在48 h仍能抑制(42.30±7.92)%的細(xì)胞遷移,4種重組蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用相似；Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD能夠顯著地抑制管狀結(jié)構(gòu)的形成,與對照組相比其抑制率分別為(60.77±8.42)%、(60.30±8.41)%、(64.89±6.38)%和(61.70±6.38)%。結(jié)果表明,在Es的N端和C端分別引入Tat PTD和RGD后,并沒有對Es的活性產(chǎn)生顯著性影響。采用air-lifting多層培養(yǎng)大鼠角膜上皮細(xì)胞(rat corneal epithelial cell, RCEC)構(gòu)建體外角膜屏障,采用大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat retinal microvascular endothelial cell, RMEC)和大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞(rat retina microvascular pericytes, RRPC)共培養(yǎng)的方法構(gòu)建體外血-視網(wǎng)膜屏障(blood retina barrier,BRB)；通過測定跨膜電阻(Trans-epithelial electrical resistance, TEER)值和熒光素鈉(Na-F)滲透率對上述兩種屏障的性能進(jìn)行評價；用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記目的蛋白,通過熒光酶標(biāo)儀來測定穿透屏障的重組蛋白濃度從而判定不同重組蛋白的穿膜能力；利用S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine, SNAP)上調(diào)BRB共培養(yǎng)物中RMEC表面整合素αvβ3的表達(dá)量,考察FITC標(biāo)記的Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD的穿膜能力,間接反應(yīng)兩種重組蛋白與RMEC表面整合素αvβ3的結(jié)合能力。結(jié)果表明,采用上述方法建立的體外角膜屏障和BRB均具有較好的生物膜屏障的特性；對于角膜屏障,與Es相比,Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD組均在下室中檢測到較高的熒光強(qiáng)度,且具有顯著性差異,而Es-RGD沒有顯著性差異,這表明Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD具有較強(qiáng)的穿透角膜屏障的能力；BRB模型中檢測到與角膜屏障相似的結(jié)果,表明相對于Es而言,Tat PTD-Es和TatPTD-Es-RGD同樣具有較強(qiáng)的穿透BRB的能力；與未加入SNAP刺激的BRB模型相比,Tat PTD-Es-RGD的穿膜能力顯著性地降低,而Tat PTD-Es并未與之前表現(xiàn)出顯著性差異,由此可以間接證明Tat PTD-Es-RGD與RMEC表面的整合素αvβ3具有較高的親和性。(3) Tat PTD-Es-RGD眼部藥代動力學(xué)及藥效學(xué)研究對重組蛋白的眼部藥代動力學(xué)進(jìn)行研究,考察4種重組蛋白在滴眼給藥后能否到達(dá)視網(wǎng)膜及在視網(wǎng)膜的代謝情況。結(jié)果顯示Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD在視網(wǎng)膜中的最高濃度(Cmax值)分別為(8.43±0.85)ng/mg和(9.42±0.77)ng/mg,與Es最高濃度(0.68±0.10)ng/mg相比,顯著性升高。Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD在視網(wǎng)膜中的半衰期(T1/2)分別為(9.64±1.31)h和(11.03±1.95)h,另外兩種蛋白質(zhì)的半衰期沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明帶有Tat PTD的重組蛋白能夠通過局部滴眼到達(dá)眼底,而且Tat PTD-Es-RGD的濃度相對較高。建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy, OIR)模型,通過滴眼給藥后,對4種重組蛋白的藥效學(xué)進(jìn)行評價。視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果表明,與負(fù)對照組相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼組的無灌注區(qū)面積和新生血管簇面積顯著性降低,且Tat PTD-Es-RGD滴眼組的效果要顯著優(yōu)于Tat PTD-Es;HE染色結(jié)果說明,與負(fù)對照組相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼組突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的細(xì)胞核數(shù)顯著性地降低,且Tat PTD-Es-RGD滴眼組更低；免疫組化結(jié)果顯示,與負(fù)對照組相比,Tat PTD-Es-RGD和Tat PTD-Es滴眼能夠顯著性地抑制VEGF在視網(wǎng)膜處的表達(dá),且外源性Es的染色結(jié)果顯示,這兩種重組蛋白通過滴眼給藥的方式能夠到達(dá)視網(wǎng)膜。以上結(jié)果證明,Tat PTD-Es-RGD和TatPTD-Es均能夠通過局部滴眼的給藥方式到達(dá)視網(wǎng)膜并發(fā)揮抑制新生血管生成的活性,且由于靶向肽RGD的引入使得Tat PTD-Es-RGD的效果要優(yōu)于Tat PTD-Es。(4) Tat PTD-Es-RGD抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性的研究建立黑色素瘤B16-F10人工肺轉(zhuǎn)移模型,考察重組蛋白對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。結(jié)果顯示,造模后腹腔注射不同重組蛋白(20 mg/kg)14 d,均能顯著性降低小鼠肺表面的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù),且Tat PTD-Es-RGD組的結(jié)節(jié)數(shù)要顯著地低于其它3種重組蛋白組；HE染色結(jié)果表明給藥組的肺組織腫瘤結(jié)節(jié)面積明顯降低,細(xì)胞核異性數(shù)明顯減少,并少見炎癥細(xì)胞浸潤,其中Tat PTD-Es-RGD組的腫瘤結(jié)節(jié)的面積最小。免疫組化結(jié)果顯示,4種重組蛋白均能顯著性地抑制CD34的表達(dá),CD34+微血管面積與陰性對照組相比顯著性降低,其中在Tat PTD-Es-RGD組中達(dá)到最低。這表明,重組蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均具有較好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性,其中Tat PTD-Es-RGD的活性要顯著高于其它3種重組蛋白。本研究取得的成果和結(jié)論：(1)首次構(gòu)建出大腸桿菌表達(dá)菌株pET28a(+)-Tat PTD-Es-RGD,并成功獲得純度較高的重組蛋白。(2)重組蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均能在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、血管生成及CAM血管生成,并表現(xiàn)出較好的體外活性。(3) Tat PTD能夠攜帶Es穿透體外角膜屏障和BRB,而Tat PTD-Es-RGD與RMEC表面整合素αvβ3分子具有較高的親和性。(4)重組蛋白Tat PTD-Es和Tat PTD-Es-RGD能夠通過局部滴眼到達(dá)視網(wǎng)膜并發(fā)揮較好的藥效,并且Tat PTD-Es-RGD的藥效要優(yōu)于Tat PTD-Es。(5)重組蛋白Es、Tat PTD-Es、Es-RGD和Tat PTD-Es-RGD均具有較好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性,其中Tat PTD-Es-RGD的活性要顯著高于其它3種重組蛋白。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 楊益金;陸俊佳;覃霞;暢榮妮;賴青鳥;華榮;方玲;吳華裕;侯偉;吳飛翔;謝彤;袁志剛;舒?zhèn)?;人與鼠源內(nèi)皮抑制素不同標(biāo)簽重組蛋白的表達(dá)純化及活性分析[J];過程工程學(xué)報;2014年04期

2 夏鑄;丁惠惠;張萬萍;余瑜;;全長hPPARγ重組蛋白的可溶性表達(dá)、純化及活性鑒定[J];光譜實(shí)驗(yàn)室;2013年02期

3 何冰芳;米蘭;陳文華;;大腸桿菌蛋白質(zhì)分泌機(jī)理及其重組蛋白分泌表達(dá)新進(jìn)展[J];食品與生物技術(shù)學(xué)報;2012年06期

4 武瑤;梁雯婧;李成;商旭;叢麗娜;;熱處理對海參溶菌酶C端多肽的抑菌活性和結(jié)構(gòu)的影響[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報;2014年05期

5 孫國鳳;;制造重組蛋白的全自動化工廠[J];生物技術(shù)通報;1992年03期

6 黃六容;蔣露銀;陳文瑞;梁徽鐵;王繼華;馬海樂;;超聲對大腸桿菌生長和重組蛋白表達(dá)的影響[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2014年04期

7 宗志鵬;步翠玉;張耀洲;;家蠶一個DDRGK超家族成員的克隆及分析[J];浙江理工大學(xué)學(xué)報;2010年04期

8 ;[J];;年期

相關(guān)會議論文 前10條

1 衛(wèi)紅飛;王麗穎;;重組蛋白發(fā)酵[A];東北三省生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會2008年學(xué)術(shù)交流會論文摘要[C];2008年

2 關(guān)怡新;姚善涇;;重組蛋白的體外復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展[A];浙江省化工學(xué)會成立五十周年慶祝大會暨第二屆省（市）際化學(xué)化工科技發(fā)展研討會論文集[C];2001年

3 潘夕春;丁國富;周紅;;人TLR9受體LRR8片段在大腸桿菌中的重組表達(dá)[A];中國藥理學(xué)會化療藥理專業(yè)委員會第九屆學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2008年

4 任道鋒;;旋毛蟲基因Ts43原核表達(dá)及重組蛋白鑒定[A];蘇州市自然科學(xué)優(yōu)秀學(xué)術(shù)論文匯編(2008-2009)[C];2010年

5 曹珊珊;吳開春;張英起;樊代明;;重組蛋白GX1-nrhTNFα的表達(dá)，純化和功能研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國消化病學(xué)術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

6 譚江琳;袁順宗;彭旭;馬兵;黃正根;程文廣;王小娟;甘成軍;賈雄飛;王慶紅;賀偉峰;胡婕;張小容;胡曉紅;羅高興;吳軍;;人重組蛋白P311的原核表達(dá)純化與鑒定[A];第八屆全國燒傷外科學(xué)年會論文匯編[C];2007年

7 周曄;蔣天舒;陳燕;婁加陶;吳傳勇;陳波;谷明莉;仲人前;鄧安梅;;結(jié)核桿菌Ag85A重組蛋白的免疫原性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議資料匯編[C];2008年

8 李存保;王美玲;;尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)基因的克隆與原核表達(dá)[A];第三屆泛環(huán)渤海（七省二市）生物化學(xué)與分子生物學(xué)會——2012年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2012年

9 王玉梅;孟多佳;時成波;常軍亮;張寧;遲春萍;曹玉鋒;于愛東;;抗戊型肝炎病毒重組蛋白P179單克隆抗體的制備及應(yīng)用[A];2011中國生物制品年會暨第十一次全國生物制品學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

10 張靈霞;吳雪瓊;史迎昌;梁建琴;張俊仙;;幾種結(jié)核分支桿菌重組蛋白誘發(fā)豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的研究[A];中國防癆協(xié)會全國學(xué)術(shù)會議大會學(xué)術(shù)報告[C];2001年

相關(guān)重要報紙文章 前4條

1 劉成剛　左朝勝;復(fù)能與羅氏攜手人類重組蛋白研發(fā)[N];科技日報;2006年

2 記者 姜煜;前七月本市民企進(jìn)出口同比增76%[N];北京日報;2011年

3 何麗君;哈四個高技術(shù)項(xiàng)目通過驗(yàn)收[N];黑龍江經(jīng)濟(jì)報;2009年

4 記者 薛婧;哈爾濱再添新動力[N];黑龍江日報;2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李妍;具有眼球屏障穿過作用的Tat PTD-Endostatin-RGD的制備、滴眼抑制眼底新生血管生成及眼部藥代動力學(xué)研究[D];山東大學(xué);2016年

2 于長明;利用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

3 丁大勇;重組再生蛋白3的表達(dá)及抗菌活性的研究[D];吉林大學(xué);2015年

4 孫蕊;雙功能重組蛋白靶向免疫治療腫瘤研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

5 劉文俊;基于逆向相變和自裂解的重組蛋白表達(dá)和純化系統(tǒng)的建立與應(yīng)用[D];揚(yáng)州大學(xué);2014年

6 王盛典;人白細(xì)胞介素15cDNA克隆和在大腸桿菌中高效表達(dá)及其重組蛋白的純化[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1998年

7 張晶;小鼠白介素1受體拮抗劑重組蛋白的制備及其預(yù)防化療骨髓毒副作用的研究[D];上海交通大學(xué);2008年

8 盧愛桃;STLV-1/BV重組蛋白ELISA診斷試劑盒的研發(fā)及液相芯片診斷方法的建立[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 徐莉娟;診治法布萊氏病的單抗及重組蛋白的研制[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

10 潘紅春;重組蛋白hCH-2的PEG修飾及其初步特性研究[D];重慶大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張易;灰葡萄孢蛋白激發(fā)子BcSpl1誘導(dǎo)番茄抗病機(jī)制研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 郝明強(qiáng);表達(dá)HPV6型L2△E7E6重組蛋白的工程菌株構(gòu)建及免疫效果評價[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2012年

3 齊亞坤;化膿性鏈球菌溶血素O和人視黃醇結(jié)合蛋白的表達(dá)與純化[D];南京師范大學(xué);2015年

4 解帥帥;GlnRS與ArgRS多抗的制備及表達(dá)分析[D];蘇州大學(xué);2016年

5 劉會珍;擬南芥IAA7和TIR1在E.coli和果蠅S2表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 商鵬飛;雞內(nèi)脂素的原核表達(dá)及活性測定[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 黃夏冰;共抑制分子VISTA胞外段重組蛋白表達(dá)及其對EAE小鼠治療作用的研究[D];鄭州大學(xué);2016年

8 何賽;人Irisin重組蛋白的表達(dá)、分離純化及活性鑒定[D];中國礦業(yè)大學(xué);2016年

9 張文月;重組蛋白Tat-TPI誘導(dǎo)的CD8~+T細(xì)胞應(yīng)答參與抗日本血吸蟲感染的保護(hù)性免疫研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

10 韓彥鋒;hTFPI重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

，

本文編號：1931824