本文選題：姜黃素衍生物抗腫瘤活性 + Hsp90��； 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：研究姜黃素衍生物C213干擾線粒體Hsp90功能和抗白血病作用。 方法： 1.利用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測C213對K562、HL60、MCF-7、SMMC-7721、HT-29、SW620、CNE2、SGC7901和KB等腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。 2.通過western blot法和免疫共沉淀法對比C213與姜黃素Cur對熱休克相關(guān)蛋白和Hsp90客戶蛋白表達(dá)量的影響，來考察C213對白血病細(xì)胞中Hsp90分子伴侶功能的影響。 3.采用JC-1染色K562和HL60細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀來檢測C213對白血病細(xì)胞線粒體膜電位影響；采用western blot方法，考察C213對K562和HL60細(xì)胞Caspase凋亡途徑的影響；采用Annexin V/FITC凋亡試劑盒，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測C213對K562和HL60細(xì)胞狀態(tài)分布的影響。 4.應(yīng)用線粒體蛋白提取試劑盒，提取K562和HL60細(xì)胞的線粒體蛋白，用各細(xì)胞器的標(biāo)志蛋白檢測線粒體蛋白的純度；應(yīng)用免疫共沉淀法，以CypD抑制劑環(huán)孢菌素CsA和經(jīng)典的胞漿Hsp90抑制劑為對照，考察C213對線粒體蛋白中Hsp90-CypD復(fù)合物的影響。 5.采用Western blot法檢測C213對K562和HL60細(xì)胞周期蛋白因子的影響；通過PI染色，用流式細(xì)胞儀檢測C213對白血病細(xì)胞周期分布的影響。 結(jié)果： 1.姜黃素衍生物C213在體外能抑制K562、HL60、MCF-7、SMMC-7721、HT-29、SW620、CNE2、SGC7901和KB等細(xì)胞的增殖，C213處理腫瘤細(xì)胞48小時(shí)后，MTT法測得IC50值在1-10μM之間，對白血病K562和HL60的效果最好，分別為1.01和0.87μM。 2.用K562腫瘤細(xì)胞裂解液，對Hsp90進(jìn)行免疫共沉淀，與對照組相比，可引起與Hsp90結(jié)合的客戶蛋白Akt和P210Bcr-abl的含量下降。通過C213（0.5,1, 2μM）和Cur（2.5,5,10μM）分別處理K562細(xì)胞24h后，免疫印記顯示細(xì)胞中的Hsp70的含量上升， Hsp90、p23和p60HOP的蛋白含量無明顯變化，同時(shí)細(xì)胞中的Hsp90客戶蛋白Bcr-Abl、Akt的表達(dá)下降，并且呈劑量依賴關(guān)系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測C213對Hsp90分子伴侶功能抑制的作用與Cur相似，并且活性要強(qiáng)于Cur。MG132是一個(gè)常用的蛋白酶體抑制劑，可以逆轉(zhuǎn)由蛋白酶體途徑引起的蛋白的降解，用C213作用于K5622h后，再加入MG132共同孵育2h。從免疫印跡的結(jié)果分析，MG132可以完全阻斷由C213引起的Hsp90客戶蛋白的降解。 3.0、0.5、1、2μMC213處理K562細(xì)胞發(fā)生線粒體膜電位變化的比例為：14.0%、21.6%、37.0%、43.7%，相同濃度的C213處理HL60細(xì)胞發(fā)生線粒體膜變化的比例為：14.3%、22.5%、42.4%、51.7%；2μMC213處理K562細(xì)胞0、15、30、60min后，發(fā)生線粒體膜變化的比例為：17.0%、21.8%、30.3%、39.7%，相同濃度的C213處理HL60細(xì)胞發(fā)生線粒體膜變化的比例為：15.7%、19.3%、31.5%、40.2%；0、0.5、1、2μMC213作用于K562和HL60細(xì)胞后，Caspase3和9及ParP下調(diào)，其裂解片段表達(dá)量上升，抗凋亡因子Bcl-2下調(diào)， CytC表達(dá)量上升；C213作用于K562和HL60細(xì)胞24h，隨著藥物濃度的增大，，早期凋亡的細(xì)胞所占的比例越來越大。 4.用各細(xì)胞器的標(biāo)志蛋白western blot檢測證明提取的線粒體蛋白基本上可以排除其他細(xì)胞器中蛋白的干擾。對HL60和K562的線粒體蛋白進(jìn)行Hsp90免疫共沉淀，C213均可以顯著地降低與Hsp90相結(jié)合的CypD，而CypD抑制劑環(huán)孢菌素CsA和經(jīng)典的胞漿Hsp90抑制劑均不能干擾線粒體內(nèi)的Hsp90-CypD復(fù)合物結(jié)合。 5. C213濃度的增大，細(xì)胞周期蛋白CDK4和CDK6沒有明顯的變化， Cdc2表達(dá)量下降，p21的表達(dá)量上調(diào)；由流式細(xì)胞儀測得，C213處理24h的白血病細(xì)胞K562和HL60表現(xiàn)出明顯的G2/M期阻滯。 結(jié)論： 1.姜黃素衍生物C213對多種腫瘤細(xì)胞的惡性增殖具有明顯的抑制作用。 2. C213能夠干擾Hsp90分子伴侶功能，對熱休克蛋白及Hsp90客戶蛋白的影響效果與Cur相似。 3. C213能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞K562和HL60進(jìn)行線粒體凋亡，導(dǎo)致線粒體膜電位耗散，引起caspase級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生細(xì)胞早期凋亡。 4. C213能夠特異性的干擾線粒體Hsp90功能，阻斷Hsp90與CypD的結(jié)合。 5. C213能干擾白血病細(xì)胞K562和HL60的細(xì)胞周期運(yùn)行，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。
[Abstract]:Objective: To study the function of curcumin derivative C213 on mitochondrial Hsp90 and its anti leukemia effect.
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本文編號：1913859