本文選題：M通道 + C15��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：KCNQ基因編碼的離子通道屬于電壓依賴性鉀通道Kv7家族，目前發(fā)現(xiàn)KCNQ1～KCNQ5五個(gè)成員，其中KCNQ2和KCNQ5分別與KCNQ3形成的雜合體是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)M通道分子基礎(chǔ)，所記錄的電流稱為M樣電流（Im），具有慢激活、非失活、電壓依賴特征，由于該通道在神經(jīng)閾電位附近開放，對神經(jīng)動(dòng)作電位的發(fā)放影響較大，尤其是在維持神經(jīng)細(xì)胞興奮性、靜息膜電位、突觸遞質(zhì)釋放等許多神經(jīng)活動(dòng)方面扮演重要的角色。而調(diào)節(jié)該類通道也成為治療癲癇、驚厥、病理性神經(jīng)疼痛等多種神經(jīng)性疾病一個(gè)重要途徑。雙氯芬酸（Diclofenac）、氟吡汀（Flupirtine）作為非阿片類鎮(zhèn)痛藥能明顯增強(qiáng)KCNQ電流。瑞替加濱（Retigabine）是一個(gè)選擇性較高的KCNQ通道開放劑，可用于癲癇部分發(fā)作的輔助治療。 C15是經(jīng)高通量篩選發(fā)現(xiàn)的一個(gè)活性化合物，結(jié)構(gòu)比較新穎，對KNQ2/3通道有良好地開放活性。本文在此基礎(chǔ)上對C15調(diào)節(jié)KCNQ通道的特征、規(guī)律以及可能的機(jī)制進(jìn)行了探討，以期為開發(fā)成新藥提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 目的：通過在表達(dá)系統(tǒng)和原代培養(yǎng)細(xì)胞上用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄KCNQ/M型電流，觀察化合物C15對KCNQ/M通道的調(diào)節(jié)特征和規(guī)律；利用電流鉗技術(shù)在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細(xì)胞上觀察C15對動(dòng)作電位的影響，分析C15對神經(jīng)興奮性的調(diào)節(jié)作用。 方法： (1)通道表達(dá)：利用分子生物學(xué)方法將KCNQ通道基因克隆在pcDNA3.0質(zhì)粒載體上，報(bào)告基因GFP克隆在pEGFP-N1質(zhì)粒上，用TOP10感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增之后用試劑盒提取，，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)鑒定質(zhì)粒的純度與濃度。在HEK293B細(xì)胞上，KCNQ2、KCNQ3及GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，在倒置熒光顯微鏡上用450～490nm（藍(lán)光）激發(fā)觀察通道表達(dá)情況。 (2)電流記錄：利用Axon700B膜片鉗系統(tǒng)，在HEK293表達(dá)體系用兩性霉素B為打孔劑，全細(xì)胞電壓鉗方式記錄KCNQ電流；在原代培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元，以吸破的全細(xì)胞膜片鉗方式記錄M電流，觀察化合物C15對KCNQ2/3電流和M電流的調(diào)節(jié)作用。 (3)動(dòng)作電位記錄：利用Axon700B膜片鉗系統(tǒng)，在DRG神經(jīng)元上用電流鉗的方式，記錄DRG神經(jīng)元膜電位和動(dòng)作電位，觀察C15和工具藥XE991對二者的影響。 結(jié)果： (1)質(zhì)粒提取與鑒定結(jié)果：克隆在pcDNA3.0(5.4Kbp)載體上的KCNQ質(zhì)粒電泳條帶和綠色熒光蛋白pEGFP-N1(4.8Kbp)質(zhì)粒的電泳條帶均在5000bp左右。ND-1000紫外/可見光分光光度計(jì)測得質(zhì)粒DNA的濃度值，其中KCNQ濃度均在200~500ng/μL之間，GFP均在200~500ng/μL之間；OD260/OD280值均在1.8~1.9之間。 (2)化合物C15濃度依賴性增強(qiáng)KCNQ2/3通道電流：當(dāng)給予10μmolC15引起KCNQ2/3通道激活電流和去活電流均明顯增大。繼而給予不同濃度的C15溶液（0.01μmol～60μmol）記錄，以濃度為橫坐標(biāo)，電流變化值為縱坐標(biāo)，采用logistic方程進(jìn)行擬合，得到其量效關(guān)系曲線，半數(shù)有效量EC50為0.59±0.03μmol（n=8）。 (3)化合物C15可濃度依賴性增強(qiáng)KCNQ2/3通道激活電壓：將不同激活電壓下所得到的去活尾電流統(tǒng)一進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，擬合得到KCNQ2/3通道I-V曲線圖。給予0.04，0.2，1，5，20μmol不同濃度C15后，通道激活電壓逐漸向超極化方向移。以C15的濃度為橫坐標(biāo)，V變化量為縱坐標(biāo)繪制的量效關(guān)系曲線，用Boltzmann方程擬合，得EC50值為0.8±0.1μmol。 (4)化合物C15對KCNQ2/3通道動(dòng)力學(xué)特征的影響：用單指數(shù)方程對通道激活和去活電流擬合得到一個(gè)衡量通道開放快慢的時(shí)間參數(shù)（tau值，τ），統(tǒng)計(jì)得到C15（20μmol）能顯著延長通道激活和去活時(shí)間參數(shù)（P0.05，n=5），。 (5)化合物C15對不同亞型KCNQ通道的選擇性：C15（1μmol）可不同程度增強(qiáng)KCNQ1，KCNQ2，KCNQ4，KCNQ5，KCNQ2+3通道電流。并且使各通道激活曲線向超極化方向移動(dòng)。C15對KCNQ3通道作用不明顯，但對KCNQ2/3雜合通道影響較大。 C15對KCNQ通道動(dòng)力學(xué)影響，主要表現(xiàn)：可延長通道激活和去活時(shí)程，但對去活時(shí)間常數(shù)的影響比激活時(shí)間常數(shù)更明顯。尤其是對KCNQ1、KCNQ2和KCNQ2/3的影響最明顯。 (6)化合物C15對KCNQ2通道不同突變體的影響：C15（1μmol）對KCNQ2兩個(gè)突變體KCNQ2(R207W)、KCNQ2（A306T）有明顯的調(diào)節(jié)作用，但對另外一種KCNQ2突變體（Y284C）的作用不明顯。其1μmol，10μmolC15對KCNQ2（Y284C）通道V作用均不明顯。 (7) C15對大鼠背根神經(jīng)節(jié)上M電流的影響：記錄大鼠背根神經(jīng)元上的M電流。C15（10μmol）能夠顯著增加M電流21%（n=8），但其作用要稍弱于對照藥RTG（P0.05，n=8）。C15還可以顯著性導(dǎo)致背根神經(jīng)元靜息膜電位向超極化方向移動(dòng)。給予XE991后基本可以消除C15引起的細(xì)胞靜息膜電位變化。另一方面，C15可以減弱簇狀神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏谋l(fā)次數(shù)，顯著降低神經(jīng)元興奮性。 結(jié)論：（1） C15能夠濃度依賴性增強(qiáng)KCNQ2/3電流，EC50為0.59±0.03μmol。C15使KCNQ2/3通道激活的I-V曲線向超極化電壓方向移動(dòng)，同時(shí)延長激活和去活的時(shí)間常數(shù)，影響通道動(dòng)力學(xué)特征。（2） C15對KCNQ1，KCNQ2， KCNQ4，KCNQ5四個(gè)亞型鉀通道均用調(diào)節(jié)作用，雖然對KCNQ3作用不明顯但對KCNQ2/3雜合體蛋白通道作用明顯。（3）C15增強(qiáng)大鼠背根神經(jīng)元M電流，引發(fā)神經(jīng)元靜息膜電位向超極化方向移動(dòng)，降低動(dòng)作電位的爆發(fā)。
[Abstract]:The ion channel encoded by the KCNQ gene belongs to the voltage dependent potassium channel Kv7 family. At present, five members of the KCNQ1 to KCNQ5 are found. The complex formed by KCNQ2 and KCNQ5 and KCNQ3 is the molecular basis of the M channel of the nervous system, and the recorded current is called the M like current (Im), which has slow activation, non inactivation and voltage dependence, due to this pass. The channel is open near the nerve threshold potential, which has a great influence on the release of nerve action potential, especially in the maintenance of nerve cell excitability, resting membrane potential, synaptic transmitter release and so on. An important way. Diclofenac (Diclofenac) and Flupirtine as a non opioid analgesic can significantly enhance the KCNQ current. Ritegbin (Retigabine) is a highly selective KCNQ channel opener, which can be used in the adjuvant treatment of partial seizures.
C15 is an active compound found by high throughput screening. The structure is novel and has a good open activity to the KNQ2/3 channel. On this basis, the characteristics, rules and possible mechanisms of C15 regulation of KCNQ channel are discussed in this paper, in order to provide valuable experimental data for developing new drugs.
Objective: To observe the regulation characteristics and regularities of compound C15 on KCNQ/M channel by recording KCNQ/M current with whole cell patch clamp technique on the expression system and primary culture cells, and to observe the effect of C15 on the action potential on the primary cultured neurons and the dorsal root ganglion (DRG) cells by using the current clamp technique, and analyze the excitatory effect of C15 on the nerve. The regulation of sex.
Method錛

本文編號：1883798