本文選題：組織蛋白酶D + α-synuclein��； 參考：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的:探討組織蛋白酶D(cathepsin D)在帕金森病動物模型中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元中功能抑制導(dǎo)致α-synuclein聚積的機制;初步探索多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中cathepsin D的調(diào)控機制。方法:在魚藤酮皮下注射Lewis大鼠(8周)制備的帕金森大鼠模型和魚藤酮(500nM)干預(yù)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,免疫熒光和免疫印跡法檢測魚藤酮引起的多巴胺能神經(jīng)元受損,溶酶體標(biāo)記蛋白LAMP-1的表達(dá)情況,α-synuclein和cathepsin D蛋白表達(dá)狀態(tài)改變,RT-PCR和real-time PCR法檢測mRNA水平,并檢測魚藤酮對SH-SY5Y細(xì)胞中cathepsin D酶活性的影響。將慢病毒構(gòu)建的cathepsin D RNA干擾(LV-ctsd-RNAi-GFP)通過立體定位法注射到大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)致密部,免疫熒光法檢測病毒感染位置和效率,Western blot檢測LV-ctsd-RNAi對多巴胺能神經(jīng)元存活及cathepsin D蛋白和α-synuclein蛋白表達(dá)狀態(tài)的影響。在SH-SY5Y細(xì)胞中給予慢病毒構(gòu)建的cathepsin D干擾處理后,熒光顯微鏡觀察病毒感染率;CCK-8檢測LV-ctsd-RNAi對細(xì)胞增殖能力的影響;Western blot檢測LV-ctsd-RNAi對細(xì)胞中cathepsin D蛋白和α-synuclein蛋白表達(dá)的影響。在SH-SY5Y細(xì)胞和cathepsin D基因被敲低的SH-SY5Y細(xì)胞中,采用自噬誘導(dǎo)劑海藻糖(Trehalose)誘導(dǎo)自噬后,給予魚藤酮干預(yù),使被魚藤酮阻滯的自噬流得到部分恢復(fù),比較兩種細(xì)胞中自噬底物蛋白的水平,研究cathepsin D在自噬溶酶體通路中的作用。組織蛋白酶L(Cathepsin L)特異性抑制劑Z-FY-CHO預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞后,魚藤酮干預(yù)細(xì)胞,Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)cathepsin L,cathepsin D,以及自噬底物蛋白LC3II、P62和α-synuclein的蛋白水平,初步研究cathepsin L對cathepsin D的調(diào)控作用。結(jié)果:魚藤酮長期皮下給藥能導(dǎo)致Lewis大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞丟失,發(fā)生病變的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)有大量α-synuclein聚積,成熟cathepsin D蛋白水平降低,同時溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP-1表達(dá)顯著降低,且cathepsin D表達(dá)減少的神經(jīng)元內(nèi)α-synuclein聚積明顯。體外模型中,魚藤酮明顯上調(diào)α-synuclein蛋白水平,降低成熟cathepin D的蛋白水平和cathepsin D酶活性,但α-synuclein和cathepin D的mRNA水平都未見明顯變化。慢病毒介導(dǎo)的cathepsin D基因干擾,成功敲低Lewis大鼠多巴胺能神經(jīng)元和SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的cathepsin D表達(dá)水平,且影響神經(jīng)元的生存和細(xì)胞的增殖,進(jìn)一步導(dǎo)致α-synuclein蛋白蓄積。Cathepsin D基因干擾加重了魚藤酮誘導(dǎo)的自噬底物蛋白堆積。Cathepsin L抑制劑能減輕魚藤酮對cathepsin D的抑制作用,緩和魚藤酮誘導(dǎo)的自噬底物蛋白堆積。結(jié)論:在魚藤酮的毒性作用下,多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),cathepsin D的成熟受抑制和酶活性降低,導(dǎo)致自噬溶酶體通路阻滯,可能是造成α-synuclein降解障礙,從而發(fā)生聚積,引發(fā)帕金森癥的主要原因之一;保持cathepsin D的活性和蛋白降解功能可能成為治療帕金森病藥物研發(fā)的新靶點。
[Abstract]:鐩殑:鎺㈣緇勭粐铔嬬櫧閰禗(cathepsin D)鍦ㄥ笗閲戞．鐥呭姩鐗╂ā鍨嬩腑鑴戦粦璐ㄥ尯澶氬反鑳鴻兘紲炵粡鍏冧腑鍔熻兘鎶戝埗瀵艱嚧偽-synuclein鑱氱Н鐨勬満鍒，

本文編號：1876050