本文選題：熒光生物傳感技術(shù) + 末端保護��； 參考：《湖南大學》2014年碩士論文

【摘要】：生命體中蛋白質(zhì)、核酸、酶活性以及生物小分子活動信息的研究對生物醫(yī)學以及臨床診斷和治療有著非常巨大的意義。如何實時、動態(tài)、快速、準確地獲取這些生命活動的信息,就成為了分析化學科研工作者面臨的重大的挑戰(zhàn)。為了克服這個難題,就需要我們發(fā)展一些準確性高、靈敏度高以及特異性高的定性或定量的方法,達到獲取信息的目的。本論文瞄準上述挑戰(zhàn)進行研究,基于末端保護技術(shù)和納米材料發(fā)展了一系列分別以小分子、核酸、蛋白質(zhì)和酶活性為檢測對象的高靈敏性高選擇性的生物傳感技術(shù),并通過對實際樣品的分析,初步驗證了這些技術(shù)的可行性和準確性。 第2章中,在細胞表面表達的腫瘤特異性蛋白標記物對于癌癥早期檢測、診斷和治療是很有價值的目標物。我們基于吸附到DNA3’端的小分子配體和細胞表面表達的蛋白生物標志物之間的相互作用將寡核苷酸標記到細胞表面,然后EXO I能夠?qū)⒎翘禺愋訢NA降解,保持無響應(yīng),從而確保高特異性檢測。這樣,一種直接檢測核酸的方法就可以替代對于活細胞表面蛋白生物標記物的復雜的、不靈敏的檢測方法。由于DNA的信號轉(zhuǎn)換和放大的多種途徑,我們基于血紅素DNA酶、DNA模板化的AgNCs以及熒光定量PCR,設(shè)計了三種信號輸出方法分別用于檢測、成像以及定量。最終,小分子連接的可編碼DNA將會開啟一種使用免洗的無標記方法來檢測細胞膜蛋白的局面。創(chuàng)立了一種用于細胞膜蛋白質(zhì)活體檢測的簡單但有意義的平臺。與此同時,將對目標生物標志物的識別轉(zhuǎn)化為對DNA序列的編碼,并且還提供了一種同時檢測細胞膜表面的多種生物標志物的方法。比如,可以利用設(shè)計不同DNA模板來指導合成AgNCs用于多種蛋白質(zhì)的直接檢測與成像。 第3章中,多聚核苷酸激酶磷酸酶(PNKP)對DNA的去磷酸化修飾過程在許多的生理活動中起著非常重要的作用。本章以T4多聚核苷酸激酶磷酸酶(T4PNKP)為模型,利用熒光團標記的DNA探針作為T4PNKP的基質(zhì),此探針是自組裝的單鏈DNA分子。3’端修飾了磷酸基團作為目標磷酸酶的基質(zhì),一旦加入T4PNKP,T4PNKP會將探針的3’磷酸集團水解為羥基,所產(chǎn)生的3’-OH在DNA聚合酶以及dNTPs的作用下迅速擴展,之前的單鏈DNA變?yōu)殡p鏈DNA。由于雙鏈DNA和WS2納米片之間的結(jié)合力很弱,延伸后的雙鏈產(chǎn)物在WS2納米片同時同時存在時有很強的熒光發(fā)射,而我們檢測到?jīng)]有聚合酶延伸的探針具有較弱的熒光信號,并且隨著WS2納米片對單鏈DNA的吸附,熒光猝滅。WS2的超強熒光淬滅能力也為該方法提供了有較寬的線性范圍和低的檢測限,其檢測下限為0.05U/mL。另外,該方法不僅可以對T4PNKP的抑制劑進行定量表征,還適用于復雜生物環(huán)境中目標物的測定。本方法設(shè)計簡單、操作方便、靈敏度高且選擇性好,有望成為PNKP酶檢測的一種很好的選擇并能應(yīng)用于DNA損傷修復機理的研究。 第4章中,SNP對于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計和測試以及生物學的基礎(chǔ)研究是非常重要的。氧化石墨烯對于單鏈的DNA分子具有較強的吸附功能,對于熒光基團具有廣泛的猝滅功能,對于單個堿基的熒光不會猝滅。我們基于T7核酸外切酶、單個熒光基團標記的核酸探針和氧化石墨烯構(gòu)建一種簡便有效的高靈敏檢測技術(shù)用于SNP分析。該方法操作簡單,響應(yīng)快速,并且有較高的靈敏度,其檢測下限為10pM。
[Abstract]:The study of protein, nucleic acid, enzyme activity and biological small molecule activity information in the life body has great significance for biomedicine and clinical diagnosis and treatment. How to obtain the information of these life activities in real time, dynamically, quickly and accurately has become a major challenge for the researchers of analytical science and research. This problem requires us to develop some qualitative or quantitative methods of high accuracy, high sensitivity and high specificity to achieve the purpose of obtaining information. This paper aims to study the challenges mentioned above. Based on the end protection technology and nanomaterials, we have developed a series of detection targets for small molecules, nucleic acids, proteins and enzymes, respectively. Highly sensitive and highly selective Biosensing Technology, and through the analysis of actual samples, preliminarily verified the feasibility and accuracy of these technologies.
In the second chapter, the tumor specific protein markers expressed on the cell surface are valuable targets for early detection, diagnosis and treatment of cancer. We mark the oligonucleotides on the cell surface based on the interaction between the small molecular ligands adsorbed to the DNA3 'end and the protein biomarkers expressed on the cell surface, and then EXO I can be used. It is sufficient to degrade nonspecific DNA and maintain no response to ensure high specificity detection. Thus, a method of direct detection of nucleic acids can replace complex, insensitive detection methods for living cell surface protein biomarkers. We are based on heme DNA enzyme, DNA template based on a variety of pathways of signal conversion and amplification. AgNCs and fluorescent quantitative PCR designed three signal output methods for detection, imaging, and quantification. Finally, the small molecule linked coded DNA will open a unlabelled unlabelled method for detecting cell membrane proteins. A simple but meaningful flat for cell membrane protein activity detection is created. At the same time, the identification of target biomarkers is converted into encoding of DNA sequences, and a method for simultaneous detection of a variety of biomarkers on the surface of the cell membrane is provided. For example, the design of different DNA templates can be used to guide the synthesis of AgNCs for direct detection and imaging of various proteins.
In the third chapter, the dephosphorylation of DNA by polynucleotides kinase phosphatase (PNKP) plays a very important role in many physiological activities. This chapter uses T4 polykinase phosphatase (T4PNKP) as a model and uses a DNA probe labeled as a T4PNKP matrix. This probe is a self-assembled single strand DNA molecule.3 'end repair. With the phosphoric acid group as the substrate of the target phosphatase, once the T4PNKP is added, T4PNKP will hydrolyze the 3 'phosphoric acid group of the probe into hydroxyl group, and the produced 3' -OH expands rapidly under the action of DNA polymerase and dNTPs, and the previous single strand DNA becomes double stranded DNA. due to the weak binding force between the double chain DNA and WS2 nanoscale, and the extended double chain. The product has strong fluorescence emission at the same time that the WS2 nanometers simultaneously exist, and we detected that the probe without the polymerase extension has a weak fluorescence signal. And with the adsorption of WS2 nanoscale to single strand DNA, the fluorescence quenching ability of fluorescence quenching.WS2 also provides a wider linear range and low detection limit for this method. The detection limit is 0.05U/mL.. This method can not only quantify the T4PNKP inhibitors, but also be suitable for the determination of objects in complex biological environment. This method is simple in design, convenient in operation, high in sensitivity and good in selectivity. It is expected to be a good choice for PNKP enzyme detection and can be applied to the mechanism of DNA damage repair. Research.
In the fourth chapter, SNP is very important for the discovery of high risk groups, identification of disease related genes, the design and testing of drugs, and basic biological research. The graphene oxide has a strong adsorption function for single strand DNA molecules, the fluorescence group has extensive quenching function, and the fluorescence of a single base will not be quenched. Based on T7 nucleic acid exonuclease, nucleic acid probe labeled by single fluorescent group and graphene oxide, a simple and effective high sensitive detection technique is constructed for SNP analysis. This method is easy to operate, fast response, and has high sensitivity, and its detection limit is 10pM.

【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R914

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