發(fā)布時間：2018-05-09 09:11

  本文選題：法舒地爾 + Kv7鉀離子通道　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：電壓門控型Kv7（Kv7.1-7.5）鉀通道家族由KCNQ基因編碼，在調節(jié)心肌動作電位及穩(wěn)定神經(jīng)元膜電位方面發(fā)揮重要作用。Kv7.1通道主要表達于心肌組織，并與其輔助亞單位KCNE1通道共同編碼組成延遲整流鉀通道（IKs），在調節(jié)心肌細胞動作電位時程中發(fā)揮著重要作用，KCNQ1/KCNE1突變體構成遺傳性心律失常的基礎并導致長QT綜合癥。Kv7.2和Kv7.3通道以四聚體形式共表達產(chǎn)生的電流已經(jīng)被證實是M電流分子基礎。另有研究發(fā)現(xiàn)Kv7.5通道也參與M電流的形成。Kv7.2和Kv7.3通道基因突變或M通道功能失調，可引發(fā)許多中樞性疾病，如良性家族性新生兒驚厥癥（BFNC）。Kv7.4通道主要表達于內耳的耳蝸和前庭器官以及中樞聽覺傳導通路。Kv7.4通道突變被證實引發(fā)遺傳性耳聾癥（DFNA2）。近期研究發(fā)現(xiàn)Kv7.1、Kv7.4、Kv7.5通道高表達于血管平滑肌等多種平滑肌細胞。藥理學研究顯示Kv7.1對血管張力無影響，Kv7.4、Kv7.5參與血管張力的調節(jié)，Kv7.4、Kv7.5調節(jié)劑對高血壓存在潛在的治療價值。但是目前高選擇性的Kv7.4、Kv7.5調節(jié)劑尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)Rho激酶抑制劑法舒地爾（Fasudil）可選擇性激活Kv7.4/Kv7.5通道，而對其它Kv7通道無作用。 Fasudil，又名HA1077，是一種新型異喹啉磺酰胺衍生物類Rho激酶（Rho-kinase）選擇性抑制藥，能強效擴血管，可以有效緩解腦血管痙攣，臨床上主要用于改善和預防蛛網(wǎng)膜下腔出血后引起的腦血管病，腦血管痙攣及肺動脈高壓的治療。研究認為Fasudil的血管舒張作用與抑制Rho激酶有關，而我們認為Fasudil的擴血管作用還與增大Kv7鉀電流有關。此外，我們發(fā)現(xiàn)Fasudil對Kv7鉀離子通道家族的調節(jié)作用具有選擇性。 本論文以Kv7鉀離子通道家族為出發(fā)點，利用電生理穿孔膜片鉗技術及四通道微血管張力測定系統(tǒng)，研究Fasudil對表達于HEK293細胞的Kv7鉀離子通道、分離培養(yǎng)的乳大鼠的小直徑背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元細胞M通道的作用以及Fasudil對腸系膜阻力血管的作用。 1. Fasudil對表達于HEK293細胞的Kv7鉀離子通道的作用 目的：研究Fasudil對Kv7.1/KCNE1、Kv7.2、Kv7.2/Kv7.3、Kv7.4及Kv7.5的選擇性調節(jié)作用。 方法：利用電生理穿孔膜片鉗技術，觀察Fasudil對表達于HEK293細胞的Kv7鉀離子通道的作用。瑞替加濱（Retigabine，RTG，Kv7鉀離子通道開放劑）為陽性對照藥。 結果：(1)30μM Fasudil對Kv7.1/KCNE1電流無明顯作用。 (2)1μM、3μM、10μM、30μM及100μM Fasudil對Kv7.2及Kv7.2/7.3電流均無明顯作用。 (3) Fasudil可濃度依賴性地增強Kv7.4電流，10μM、30μM、100μMFasudil及10μM RTG分別使尾電流增加0.82、1.38、2.03及3.16倍。 (4) Fasudil可濃度依賴性地增強Kv7.5電流。Fasudil使電導-電壓（G-V）激活曲線左移，且左移的幅度隨濃度升高而增大。30μM Fasudil使G-V曲線由-53.7mV左移至-62.4mV，左移幅度為9.39±1.10mV；10μM RTG使曲線左移至-68.9mV，左移幅度為13.925±1.80mV。 結論：Fasudil對Kv7.4及Kv7.5電流有增大作用，而對Kv7.1/KCNE1、Kv7.2及Kv7.2/7.3電流無明顯作用，說明Fasudil對Kv7鉀電流的調節(jié)作用具有選擇性。 2. Fasudil對大鼠的小直徑背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元細胞上M電流的作用 目的：研究Fasudil對分離培養(yǎng)的大鼠的DRG神經(jīng)元M電流的影響。 方法：利用電生理穿孔膜片鉗技術，觀察Fasudil對分離培養(yǎng)的大鼠DRG神經(jīng)元細胞M型鉀電流的作用。 結果：(1)1μM、3μM、10μM、30μM及100μM Fasudil對大鼠DRG神經(jīng)元上表達的M型鉀電流無明顯作用。 (2)1μM、3μM、10μM、30μM及100μM Fasudil對大鼠DRG神經(jīng)元的靜息膜電位無明顯作用。 結論：Fasudil對大鼠DRG神經(jīng)元細胞上M電流和靜息膜電位均無明顯作用，提示Fasudil對Kv7.2/Kv7.3無明顯作用。 3. Fasudil對離體大鼠腸系膜二級阻力血管的作用 目的：研究Fasudil對離體大鼠腸系膜二級阻力血管的作用及機制。 方法：利用微血管張力測定技術，觀察Fasudil對離體大鼠腸系膜二級阻力血管的作用。每次實驗分為兩小組。Fasudil組：10μM Phe預收縮血管，待平穩(wěn)之后，依次加入不同濃度的Fasudil，記錄實驗結果；Fasudil+XE991組：10μM Phe預收縮平穩(wěn)之后，加入10μM XE991（Kv7鉀離子通道阻斷劑）孵育15min，再依次加入不同濃度的Fasudil，記錄實驗結果。 結果：Fasudil可濃度依賴性地舒張Phe預收縮的腸系膜二級阻力血管，EC50為0.83±0.25μM，，最大舒張率（Emax）為96.12%；Fasudil可濃度依賴性地舒張Phe+XE991預收縮的腸系膜二級阻力血管，量效曲線右移，EC50為5.04±0.96μM，Emax為96.46%。 結論：Fasudil舒張Phe+XE991預收縮的血管的量效曲線發(fā)生了右移，其機制可能是Fasudil增大了血管平滑肌細胞上Kv7.4及Kv7.5鉀電流，使血管舒張。提示Fasudil對Kv7.4及Kv7.5的選擇性調節(jié)作用是其舒張血管作用的機制之一。 以上研究結果表明，F(xiàn)asudil對Kv7鉀通道具有選擇性調節(jié)作用，為選擇性的Kv7鉀離子通道調節(jié)劑的開發(fā)提供了新的思路；另外，F(xiàn)asudil對Kv7.4和Kv7.5鉀電流的增大作用可能是其血管調節(jié)的作用機制之一，對其臨床應用提供了新的理論依據(jù)。
[Abstract]:The voltage gated Kv7 (Kv7.1-7.5) potassium channel family is encoded by the KCNQ gene and plays an important role in regulating the cardiac action potential and stabilizing the neuron membrane potential. The.Kv7.1 channel is mainly expressed in the myocardial tissue, and the delayed rectifier potassium channel (IKs) is composed of its auxiliary subunit KCNE1 channel, and the action potential is adjusted to regulate the action potential of the cardiac myocytes. The process plays an important role. KCNQ1/KCNE1 mutants form the basis of hereditary arrhythmia and lead to the current produced by the co expression of the long QT syndrome.Kv7.2 and Kv7.3 channels in the form of four polymer, which has been confirmed as the molecular basis of the M current. Further studies have found that Kv7.5 channels are also involved in the formation of.Kv7.2 and Kv7.3 channel gene mutations or M of the M current. Dysfunction of the channel can cause many central diseases, such as the benign familial neonatal convulsion (BFNC).Kv7.4 channel is mainly expressed in the inner ear cochlea and vestibule organs, and the.Kv7.4 channel mutation in the central auditory pathway is confirmed to cause hereditary deafness (DFNA2). Recent studies have found that Kv7.1, Kv7.4, Kv7.5 channels are highly expressed in blood vessels. A variety of smooth muscle cells such as smooth muscle cells. Pharmacological studies have shown that Kv7.1 has no effect on vascular tension, Kv7.4, Kv7.5 participates in the regulation of vascular tension, Kv7.4, Kv7.5 regulator has potential therapeutic value for hypertension. However, the high selective Kv7.4, Kv7.5 regulator has not yet been reported. This study found that the Rho kinase inhibitor FDD (Fasudi) L) selectively activates the Kv7.4/Kv7.5 channel, but has no effect on other Kv7 channels.
Fasudil, also known as HA1077, is a new type of ISO quinoline sulfonamide derivative, Rho kinase (Rho-kinase) selective inhibitor, which can effectively expand blood vessels and effectively relieve cerebral vasospasm. It is mainly used to improve and prevent cerebrovascular disease, cerebral vasospasm and pulmonary hypertension after subarachnoid hemorrhage. The study thinks Fas The vasodilatation of udil is associated with the inhibition of Rho kinase, and we believe that the vasodilatation of Fasudil is also related to the increase of the Kv7 potassium current. Furthermore, we found that Fasudil has a selective role in the regulation of the Kv7 potassium channel family.
In this paper, using the Kv7 potassium channel family as the starting point, using the electrophysiological perforation patch clamp technique and the four channel microvascular tension measurement system, the effect of Fasudil on the Kv7 potassium channel expressed in HEK293 cells, the role of the M channel of the small diameter dorsal root ganglion (DRG) of the rat's small diameter dorsal root ganglion (DRG) and the mesenteric resistance to the mesenteric obstruction were studied. The role of force and blood vessel.
Effect of 1. Fasudil on Kv7 potassium channels expressed in HEK293 cells
Objective: To study the selective regulation of Fasudil on Kv7.1/KCNE1, Kv7.2, Kv7.2/Kv7.3, Kv7.4 and Kv7.5.
Methods: the effect of Fasudil on the Kv7 potassium channel expressed in HEK293 cells was observed by electrophysiological perforation patch clamp technique. Retegine (Retigabine, RTG, Kv7 potassium channel opener) was a positive control drug.
Results: (1) 30 M Fasudil had no significant effect on Kv7.1/KCNE1 current.
(2) 1 M, 3 M, 10 M, 30 M and 100 M Fasudil had no obvious effect on Kv7.2 and Kv7.2/7.3 currents.
(3) Fasudil can enhance Kv7.4 currents in a concentration dependent manner. The 10 M, 30 M, 100 MFasudil and 10 M RTG respectively increase the tail current by 0.82,1.38,2.03 and 3.16 times.
(4) Fasudil can enhance the Kv7.5 current.Fasudil to make the conductance voltage (G-V) activation curve move left, and the amplitude of the left shift increases with the concentration of.30 mu M Fasudil to move the G-V curve from -53.7mV left to -62.4mV, and the left shift is 9.39 + 1.10mV, and the 10 mu M makes the left shift to 13.925 +.
Conclusion: Fasudil has an increasing effect on the current of Kv7.4 and Kv7.5, but has no obvious effect on the current of Kv7.1/KCNE1, Kv7.2 and Kv7.2/7.3, indicating that Fasudil has a selective effect on the regulation of the potassium current of Kv7.
Effect of 2. Fasudil on M currents in rat small diameter dorsal root ganglion (DRG) neurons
Objective: To study the effect of Fasudil on the M currents of DRG neurons isolated from rats.
Methods: electrophysiological perforation patch clamp technique was used to observe the effect of Fasudil on M type potassium currents in cultured rat DRG neurons.
Results: (1) 1 mu M, 3 M, 10 M, 30 M and 100 M Fasudil had no significant effect on M potassium currents in rat DRG neurons.
(2) 1 mu M, 3 M, 10 M, 30 M and 100 M Fasudil had no significant effect on resting membrane potential of DRG neurons in rats.
Conclusion: Fasudil has no significant effect on M current and resting membrane potential of DRG neurons in rats, suggesting that Fasudil has no significant effect on Kv7.2/Kv7.3.
Effect of 3. Fasudil on isolated rat mesenteric two grade resistance vessels
Objective: To study the effect and mechanism of Fasudil on isolated rat mesenteric two grade resistance vessels.
Methods: the effect of Fasudil on the two level resistance vessels of rat mesentery in vitro was observed by microvascular tension measurement. Each experiment was divided into two groups of.Fasudil groups: 10 u M Phe preconstricted blood vessels. After the stabilization, the experimental results were added to different concentrations of Fasudil in order, and the Fasudil+XE991 group: after the pre contraction of 10 mu M Phe was stationary, add The 15min was incubated with 10 M XE991 (Kv7 potassium channel blocker), and then the Fasudil was added in order to record the experimental results.
Results: Fasudil had a concentration dependent relaxation of Phe precontracted mesenteric two resistance vessels, EC50 was 0.83 + 0.25 mu M, and the maximum diastolic rate (Emax) was 96.12%; Fasudil could be concentrated on Phe+XE991 precontracted mesenteric two resistance vessels, the volume effect curve was shifted rightward, EC50 was 5.04 + 0.96 micron, Emax was 96.46%.
Conclusion: the volume effect curve of Fasudil diastolic Phe+XE991 precontracted blood vessels has a right shift. The mechanism may be that Fasudil increases the Kv7.4 and Kv7.5 potassium currents on vascular smooth muscle cells and makes the vasodilatation. The selective regulation of Fasudil on Kv7.4 and Kv7.5 is one of the mechanisms of vasodilatation.
The above results show that Fasudil can selectively regulate the potassium channel of Kv7 and provide a new idea for the development of selective Kv7 potassium channel regulator. In addition, the effect of Fasudil on the potassium current of Kv7.4 and Kv7.5 may be one of the mechanisms of its vascular regulation, and provides a new theoretical basis for its clinical application.

【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R96

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