本文選題：GES-1細胞 + MGC80-3細胞��； 參考：《安徽醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：目的 研究左氧氟沙星在GES-1及MGC80-3細胞上的跨膜轉(zhuǎn)運特征及可能存在的轉(zhuǎn)運體，初步探討藥物濃度、藥物孵育時間、溫度、細胞外pH值和轉(zhuǎn)運體抑制劑環(huán)孢素A、維拉帕米、西咪替丁對藥物轉(zhuǎn)運量的影響。 方法 （1）將GES-1、MGC80-3細胞與含有100、200μmol·L-1的左氧氟沙星的Hanks液共孵育1、5、7.5、10、15、30、60min后收集細胞、比較不同時間，不同濃度對左氧氟沙星在兩種細胞上轉(zhuǎn)運的影響。 （2）將GES-1、MGC80-3細胞與不同pH值及不同溫度的含100μmol·L-1左氧氟沙星的Hanks液共孵育30min后收集細胞，比較不同溫度，不同pH值對左氧氟沙星在兩種細胞上轉(zhuǎn)運的影響。 （3）將GES-1、MGC80-3細胞與含有100μmol·L-1左氧氟沙星的Hanks液及P-糖蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑環(huán)孢素A、維拉帕米和有機陽離子轉(zhuǎn)運體抑制劑西咪替丁共同孵育1、5、7.5、10、15、30min后收集細胞，比較轉(zhuǎn)運體抑制劑對左氧氟沙星在兩種細胞轉(zhuǎn)運上的影響。 （4）收集細胞樣本后經(jīng)反復凍融3次和超聲破碎細胞，采用高效液相色譜法（HPLC）測定胞內(nèi)藥物含量，考馬斯亮藍法定量細胞蛋白總量。用細胞內(nèi)藥物含量與細胞總蛋白量的比值作為觀察藥物轉(zhuǎn)運量的檢測指標。 （5）建立GES-1和MGC80-3細胞內(nèi)左氧氟沙星檢測的HPLC方法：細胞裂解樣本經(jīng)冷凍離心機12000rpm·min-1離心15min，取上清加等體積甲醇沉淀蛋白，再次取上清并經(jīng)微孔濾膜過濾，用于測定左氧氟沙星濃度，HPLC條件：流動相為乙腈-50mmol·L-1檸檬酸溶液-1mol·L-1醋酸銨溶液(17:82:1；v/v/v)，Welch C18分析柱，流速1.0ml·min-1，紫外檢測波長295nm，柱溫40℃，進樣量20μl。評價專屬性、線性、準確度、精密度、穩(wěn)定性和靈敏度。 結(jié)果 （1）GES-1和MGC80-3細胞的藥物轉(zhuǎn)運量，1-5min時明顯增加，7.5-15min緩慢增加并達到穩(wěn)態(tài)。100μmol·L-1左氧氟沙星孵育1、30min時GES-1胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是0.945±0.030μg/mg、1.198±0.086μg/mg。100μmol·L-1左氧氟沙星孵育1、30min時MGC80-3胞內(nèi)轉(zhuǎn)運量分別是0.734±0.025μg/mg、1.007±0.041μg/mg。 （2）GES-1和MGC80-3細胞的藥物轉(zhuǎn)運量，，胞外左氧氟沙星濃度為200μmol·L-1時明顯大于100μmol·L-1(P0.05)。100μmol·L-1、200μmol·L-1左氧氟沙星孵育30min時GES-1胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是1.198±0.086μg/mg、1.618±0.215μg/mg。100μmol·L-1、200μmol·L-1左氧氟沙星孵育30min時MGC80-3胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是1.007±0.041μg/mg、1.414±0.052μg/mg。 （3）GES-1和MGC80-3細胞的藥物轉(zhuǎn)運量，孵育溫度為37℃時最大，37℃大于25℃(P0.05)，但明顯大于4℃(P0.01)。100μmol·L-1左氧氟沙星置于37℃、25℃、4℃孵育30min時GES-1胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是1.173±0.057μg/mg、1.024±0.080μg/mg、0.642±0.099μg/mg。100μmol·L-1左氧氟沙星置于37℃、25℃、4℃孵育30min時MGC80-3胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是1.001±0.072μg/mg、0.846±0.056μg/mg、0.599±0.048μg/mg。 （4）GES-1和MGC80-3細胞的藥物轉(zhuǎn)運量，pH值為7.4時最大，pH7.4大于pH6.4和pH8.4(P0.05)，但明顯大于pH值為5.4時(P0.01)。100μmol·L-1左氧氟沙星在pH5.4、pH6.4、pH7.4、pH8.4下孵育30min時GES-1胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是0.822±0.047μg/mg、1.078±0.076μg/mg、1.209±0.047μg/mg、1.090±0.070μg/mg。100μmol·L-1左氧氟沙星在pH5.4、pH6.4、pH7.4、pH8.4下孵育30min時MGC80-3細胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是0.724±0.036μg/mg、0.913±0.061μg/mg、1.040±0.094μg/mg、0.902±0.091μg/mg。 （5）P-糖蛋白抑制劑（環(huán)孢素A、維拉帕米）作用組，GES-1和MGC80-3細胞上的藥物轉(zhuǎn)運量相近。100μmol·L-1左氧氟沙星+10μmol·L-1環(huán)孢素A孵育GES-1和MGC80-3細胞30min，胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是1.311±0.0850μg/mg、1.363±0.072μg/mg。各個時間點下，兩種細胞藥物轉(zhuǎn)運量都較對照組增加，GES-1細胞的藥物轉(zhuǎn)運量較對照組增加約2.07%-13.23%（P0.05)，MGC80-3細胞的藥物轉(zhuǎn)運量較對照組增加約17.51%-35.30%(P0.05)。在有機陽離子轉(zhuǎn)運體抑制劑（西咪替丁）作用下兩種細胞藥物轉(zhuǎn)運量較對照組無明顯改變。 結(jié)論 （1）左氧氟沙星在GES-1細胞和MGC80-3細胞上存在跨膜轉(zhuǎn)運，轉(zhuǎn)運有明顯的濃度、時間、溫度、pH值依賴性。P-糖蛋白可能參與左氧氟沙星在GES-1細胞上的轉(zhuǎn)運，P-糖蛋白參與了左氧氟沙星在MGC80-3細胞上的轉(zhuǎn)運。有機陽離子轉(zhuǎn)運體不參與左氧氟沙星在GES-1和MGC80-3細胞上的轉(zhuǎn)運。 （2）本實驗應用的檢測左氧氟沙星的高效液相色譜法方法，具有分離度好、準確度、精密度、穩(wěn)定性、靈敏度高的特點，可以用于檢測GES-1和MGC80-3細胞內(nèi)左氧氟沙星含量。
[Abstract]:Purpose

The trans - membrane transport characteristics of levofloxacin on GES - 1 and MGC80 - 3 cells and possible transporter were studied . The effects of drug concentration , drug incubation time , temperature , extracellular pH value , and trans - transporter inhibitor cyclosporin A , verapamil and simitedin on drug delivery were investigated .

method

( 1 ) GES - 1 , MGC80 - 3 cells were incubated with Hanks containing 100 , 200 渭mol 路 L - 1 levofloxacin for 1 , 5 , 7.5 , 10 , 15 , 30 and 60 min .

( 2 ) After incubation of GES - 1 , MGC80 - 3 cells with Hanks solution containing 100 渭mol 路 L - 1 levofloxacin at different pH and different temperatures for 30 min , the cells were collected , and the effects of different temperature and different pH values on the transport of levofloxacin on both cells were compared .

( 3 ) GES - 1 , MGC80 - 3 cells were incubated with Hanks solution containing 100 渭mol 路 L - 1 levofloxacin , P - glycoprotein transport inhibitor cyclosporin A , verapamil and organic cation transporter inhibitor simitedin for 1 , 5 , 7.5 , 10 , 15 , 30 min .

( 4 ) After collecting the cell samples , repeatedly freezing and thawing three times and ultrasonic breaking cells , the intracellular drug content is determined by high performance liquid chromatography ( HPLC ) , and the total amount of the cell protein is detected by the method of high performance liquid chromatography ( HPLC ) , and the ratio of the drug content in the cell and the total amount of the total protein of the cell is used as the detection index for observing the drug delivery amount .

( 5 ) HPLC method for detection of levofloxacin in GES - 1 and MGC80 - 3 cells was established : cell lysis samples were centrifuged at 12000 rpm 路 min - 1 for 15 min , the supernatant was collected and filtered through a microporous filter membrane to determine the concentration of levofloxacin , and the HPLC conditions were as follows : acetonitrile - 50 mmol 路 L - 1 citric acid solution - 1 mol 路 L - 1 ammonium acetate solution ( 17 : 82 : 1 ;
The specificity , linearity , accuracy , precision , stability and sensitivity were evaluated .

Results

( 1 ) The transport amount of GES - 1 and MGC80 - 3 cells increased significantly at 1 - 5 min , and the amount of intracellular drug transport was 0.945 鹵 0.030 渭g / mg , 1.198 鹵 0.086 渭g / mg and 1.198 鹵 0.086 渭g / mg , 1.007 鹵 0.041 渭g / mg respectively .

( 2 ) The drug transport capacity of GES - 1 and MGC80 - 3 cells was 1.198 鹵 0.086 渭g / mg , 1.618 鹵 0.215 渭g / mg and 1.618 鹵 0.215 渭g / mg 路 L -1 for 30 min , respectively .

( 3 ) The drug transport capacity of GES - 1 and MGC80 - 3 cells was maximum at 37 鈩

本文編號：1848742