本文選題：心肌靶向 + PCM��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：缺血性心臟病(Ischemic heart disease,IHD)是一類冠狀動脈疾病,它是世界范圍內最常見的死亡原因之一。國內外公認的傳統(tǒng)療法有藥物治療、介入治療和外科手術治療三種,其中藥物治療安全有效,但許多治療藥物不能有效濃集于心肌,所以探索新的更具靶向性的藥物載體已經成為該領域的研究趨勢。脂質體是最常用的靶向給藥系統(tǒng)之一,通過配體修飾脂質體表面,脂質體可經受體或電荷介導的內吞作用進入細胞,可有效地提高靶向效率,精確地靶向靶細胞或靶組織,從而提高生物利用度,減少副作用。PCM(WLSEAGPVVTVRALRGTGSW)是通過噬菌體展示技術篩選出的由20個氨基酸組成的肽段,是一種心肌細胞特異性靶向肽。TAT是近年來廣泛應用于修飾藥物和藥物載體的一種細胞穿膜肽,它由11個氨基酸(YGRKKRRQRRR)組成,可將與之相連的藥物或藥物載體以一種濃度依賴的方式高效、快速地導入細胞內。本文制備了PCM和TAT修飾的脂質體,以香豆素-6和EGFP質粒分別作為傳統(tǒng)藥物和基因藥物的模型藥物。通過體外和體內實驗研究了載香豆素-6的PCM和TAT雙修飾脂質體的心肌靶向性,結果表明,PCM和TAT雙修飾的脂質體具有良好的心肌靶向性。通過體外實驗初步研究了載EGFP質粒的PCM修飾的脂質體的心肌轉染效率,結果表明,PCM修飾的脂質體具有良好的心肌細胞轉染效率。本文設計并構建了PCM和TAT雙修飾的脂質體,用以提高脂質體向心肌的傳遞能力。第一部分對載香豆素-6的PCM和TAT雙修飾的脂質體的制備工藝和處方進行了篩選。首先采用操作簡單,制備工藝穩(wěn)定的薄膜分散-超聲法制備脂質體,再利用PCM-Cys和TAT-Cys中半胱氨酸的巰基與DSPE-PEG2000-MAL中馬來酰亞胺的雙鍵發(fā)生加成反應,將多肽連接于脂質體表面。以包封率為指標,篩選了香豆素-6的最佳用量及PCM和TAT的連接方式。通過研究H9C2細胞對不同脂質體的攝取率,篩選出PCM的最佳用量為脂質的3%,TAT的最佳用量為脂質的1%。篩選得到的雙修飾脂質體形態(tài)圓整,粒徑在115nm左右。第二部分對載香豆素-6的PCM和TAT雙修飾脂質體進行了體外評價,初步驗證了雙修飾脂質體的心肌靶向性。制備了載香豆素-6和未載香豆素-6的未修飾的普通脂質體Lip,3%PCM修飾的脂質體3%P-Lip,1%TAT修飾的脂質體1%T-Lip以及1%PCM和1%TAT雙修飾的脂質體3%P-1%T-Lip。通過CCK-8試驗測定了各種未載香豆素-6的脂質體的毒性,結果表明脂質體用量小于等于0.4 m M時,各種脂質體無明顯毒性。通過共聚焦顯微鏡和流式細胞術定性和定量地研究了原代心肌細胞對不同脂質體的攝取,結果各種脂質體的細胞攝取率:3%P-1%T-Lip3%P-Lip1%T-LipLip。同時還研究了游離多肽PCM和TAT對脂質體攝取的影響,結果游離PCM抑制PCM修飾脂質體的攝取,而游離TAT對TAT修飾脂質體的攝取無明顯抑制。第三部分對載香豆素-6的PCM和TAT雙修飾脂質體進行了體內評價,進一步驗證了雙修飾脂質體的心肌靶向性。首先對尾靜脈給予了載香豆素-6的各種脂質體的昆明小鼠心臟組織冰凍切片進行定性觀察,然后對尾靜脈給予載香豆素-6的各種脂質體后香豆素-6在各臟器內的含量采用HPLC-FLD法進行定量測定。定性觀察和定量測定結果顯示各種脂質體的心臟蓄積量:3%P-1%T-Lip3%P-Lip1%TLipLip,說明雙修飾脂質體具有較好的心肌靶向性。3%P-1%T-Lip,3%P-Lip,1%T-Lip和Lip在肝、脾、肺、腎等器官也有一定的分布,但3%P-1%T-Lip與對照組相比心肌蓄積量明顯增加,而在肝、脾、腎、肺的分布沒有明顯增高。第四部分對載增強綠色熒光蛋白表達質粒(p EGFP)的PCM修飾脂質體的制備工藝和體外靶向性進行了研究,擬用于提高載基因治療藥物的脂質體的心肌傳遞能力。此部分增加DOTAP為陽離子脂質材料,采用薄膜分散-超聲法制備脂質體,再將DSPE-PEG2000-PCM制成膠束插入脂質體。制備了未修飾的普通脂質體LIP,1%PCM修飾的脂質體1%P-LIP,3%PCM修飾的脂質體3%P-LIP和5%PCM修飾的脂質體5%P-LIP。通過測定PCM的連接率篩選了PCM的連接方法,通過瓊脂糖凝膠電泳考察了脂質體的載藥能力。通過定性觀察和定量測定考察了不同量PCM修飾脂質體對心肌細胞的轉染效果,篩選了PCM的最佳用量為3%。制備得到的載p EGFP的LIP和3%P-LIP的粒徑分別為212.4±2.95nm和261.9±2.20nm,連接PCM后脂質體粒徑增大。綜上所述,本課題成功制備了載香豆素-6的PCM和TAT雙修飾脂質體,經體內外實驗研究表明該系統(tǒng)是具有潛力的心臟疾病藥物傳遞系統(tǒng)。還制備了載pEGFP的PCM單修飾的脂質體,體外實驗初步證明PCM修飾的脂質體具有一定的心肌靶向性,但該系統(tǒng)還待進一步驗證其體內靶向性。
[Abstract]:In vitro and in vivo experiments have been carried out in vitro and in vivo to study the myocardial targeting properties of PCM and TAT double modified liposomes . A modified liposome was prepared by means of qualitative observation and quantitative determination . The results showed that the size of liposome was 212 . 4 鹵 2 . 95nm and 261 . 9 鹵 2 . 20 nm .

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R943

【參考文獻】

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本文編號：1843306