發(fā)布時(shí)間：2018-04-30 00:18

  本文選題：尼古丁 + 孕期被動(dòng)吸煙��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景與目的 先天性心臟病(Congenital heart defects, CHDs)是一種常見的發(fā)育缺陷疾病。流行病學(xué)的研究結(jié)果顯示,該病在美國(guó)的新生兒中的發(fā)病率為0.8-1%,而在亞洲的發(fā)病率為0.93%,是導(dǎo)致新生兒死亡的主要疾病之一。隨著醫(yī)學(xué)研究的快速發(fā)展,先天性心臟病的早期診斷和治療方法在過去的數(shù)十年間也得到不斷的進(jìn)步和改善,但該病是胚胎期心臟在母體內(nèi)的發(fā)育停滯或缺陷所致,而引起胚胎期心臟發(fā)育畸形的原因非常復(fù)雜,所以該病的病因及發(fā)病機(jī)制仍舊不明確。目前的研究中,越來(lái)越多的證據(jù)表明先天性心臟病的發(fā)生是干擾和調(diào)節(jié)心臟早期發(fā)育過程的遺傳、環(huán)境危險(xiǎn)因子和表觀遺傳學(xué)修飾共同作用的結(jié)果。 來(lái)自流行病學(xué)的研究報(bào)道,誘發(fā)先天性心臟病的環(huán)境危險(xiǎn)因子包括：妊娠早期,母親有主動(dòng)或被動(dòng)吸煙史、有飲酒史、接觸藥物或甲醛等化學(xué)試劑、先兆流產(chǎn)、病毒感染及妊娠期高血壓疾病等。一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究報(bào)道顯示,在美國(guó)處于生殖年齡的婦女中,吸煙者約占28%,其中有20%的吸煙婦女在懷孕后整個(gè)妊娠期仍舊繼續(xù)吸煙。目前流行病學(xué)的研究中已有報(bào)道,妊娠期母親吸煙是誘導(dǎo)先天性心臟病的危險(xiǎn)因素,但這一結(jié)論仍然具有爭(zhēng)議性而且對(duì)于其如何影響心臟發(fā)育和相關(guān)的調(diào)控機(jī)制也尚不清楚。吸煙過程中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)是否參與及如何影響該過程也仍未有報(bào)道。尼古丁作為香煙中的最主要的成癮和毒性成分,在吸煙引起的心血管系統(tǒng)損傷和疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵和主導(dǎo)作用。有研究報(bào)道尼古丁通過促血管生成的作用促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化并加速腫瘤的形成和進(jìn)展,但尼古丁能否及如何影響心肌細(xì)胞分化和心臟早期發(fā)育的相關(guān)研究也尚未有報(bào)道。 心臟發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)過程,包括大量的轉(zhuǎn)錄因子,心肌共轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)的信號(hào)通路共同參與和相互作用。抑制和干擾這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)能誘導(dǎo)心肌異常發(fā)育,造成心臟功能受損,這也是誘發(fā)先天性心臟病的遺傳危險(xiǎn)因素。大量研究報(bào)道,數(shù)個(gè)重要的心肌轉(zhuǎn)錄因子的基因突變或異常表達(dá)都與先天性心臟病相關(guān),比如心臟特異性同源盒轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5,鋅指轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白GATA4、T盒基因Tbx5和肌球蛋白重鏈MHC,這些與心肌分化和發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在早期胚胎中的基因突變和異常表達(dá)都能影響心肌分化并導(dǎo)致心臟發(fā)育的缺陷。在胚胎發(fā)育的早期,當(dāng)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化時(shí),促心肌分化的核轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮關(guān)鍵作用。干擾這些重要的心肌轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),能夠抑制心肌細(xì)胞的生成,從而影響心臟的發(fā)育和心功能。妊娠期母體吸煙作為誘發(fā)先天性心臟病的重要環(huán)境危險(xiǎn)因子及其主要毒性和成癮性代謝產(chǎn)物,尼古丁,是否通過干預(yù)胚胎心臟發(fā)育過程中的心肌重要因子的表達(dá)從而誘發(fā)心臟發(fā)育異常這一發(fā)病機(jī)制也尚不清楚。 表觀遺傳學(xué)調(diào)控指在不改變細(xì)胞核DNA序列的情況下,通過對(duì)基因結(jié)構(gòu)的修飾作用,基因功能發(fā)生可遺傳性及可逆性的改變。表觀遺傳學(xué)修飾是生物發(fā)育過程中重要的調(diào)控方式,主要包括DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)控和組蛋白的修飾作用。研究顯示,多種表觀遺傳學(xué)修飾作用參與了心臟發(fā)育的過程,而誘發(fā)先天性心臟病的環(huán)境危險(xiǎn)因素可通過改變表觀遺傳學(xué)修飾作用從而影響心臟發(fā)育過程。DNA甲基化是主要的表觀遺傳學(xué)修飾途徑之一,DNA甲基化水平的高低能調(diào)控基因的表達(dá),通常低甲基化促進(jìn)基因的表達(dá),而高甲基化則抑制基因的表達(dá)。這種修飾途徑發(fā)生在基因的轉(zhuǎn)錄過程,當(dāng)親代受到環(huán)境因素的影響下,DNA甲基化水平發(fā)生改變,從而影響子代基因的表達(dá)水平。已有研究報(bào)道,妊娠期影響親代的環(huán)境危險(xiǎn)因素能夠改變子代心臟組織中某些心肌重要轉(zhuǎn)錄因子的甲基化水平。另外,大量的研究報(bào)道顯示,在干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中,通過影響分化過程中的某些心肌重要轉(zhuǎn)錄因子的甲基化水平,可調(diào)控其基因表達(dá)水平,從而影響干細(xì)胞向心肌分化的效率。在胚胎心臟發(fā)育的早期,尼古丁能否通過調(diào)控心肌分化和發(fā)育過程中重要轉(zhuǎn)錄因子的甲基化水平,進(jìn)而影響其基因和蛋白的表達(dá)水平,并最終干擾心肌分化和發(fā)育,這正是本研究的所要探討和研究的重點(diǎn)。 DNA表觀遺傳學(xué)修飾是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下,胞嘧啶受甲基化后,在5號(hào)碳上附加一個(gè)甲基,形成5-甲基胞嘧啶,使DNA的型態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。當(dāng)胞嘧啶被甲基化后,DNA的序列仍舊不變,但被甲基化的基因的表達(dá)則會(huì)改變,通常低甲基化增加基因的表達(dá)水平,而高甲基化則降低其表達(dá)水平。因此,5-甲基胞嘧啶和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的水平是檢測(cè)DNA甲基化水平的重要指標(biāo)。心肌分化和心臟發(fā)育過程中,需要大量的心肌特異轉(zhuǎn)錄因子的參與和調(diào)控,影響心臟發(fā)育的環(huán)境危險(xiǎn)因素可通過表觀遺傳學(xué)修飾作用誘導(dǎo)DNA甲基化,從而改變心肌轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。 小鼠胚胎干細(xì)胞(Mouse Embryonic Stem cells, mESCs),具有自我更新和多向分化潛能,在一定的培養(yǎng)條件下(干細(xì)胞培養(yǎng)基：含白血病抑制因子,Leukemia inhibitory factor, LIF)可以長(zhǎng)期維持自我更新能力,而在分化培養(yǎng)基(不含LIF)和懸滴培養(yǎng)條件下可形成具有內(nèi)、中、外3胚層結(jié)構(gòu)的擬胚體(Embryoid Bodies,EBs)。這些擬胚體向心肌細(xì)胞的分化過程與早期胚胎發(fā)育過程相似,可以模擬胚胎發(fā)育早期原腸運(yùn)動(dòng)前期到早期的發(fā)育過程。小鼠胚胎干細(xì)胞通過懸滴法制備形成擬胚體后在分化培養(yǎng)基的作用下,能夠貼壁自然分化,并形成具有自發(fā)性、節(jié)律性收縮的心肌細(xì)胞,擬胚體模擬心肌分化的模型被廣泛的用于體外模型心肌分化的研究中。因此,本研究的體外實(shí)驗(yàn)部分選用小鼠胚胎干細(xì)胞制備成的擬胚體定向心肌細(xì)胞分化的模型,以檢測(cè)尼古丁對(duì)心肌分化影響及其相關(guān)機(jī)制的研究。 本研究從體內(nèi)早期胚胎發(fā)育的模型中,探討妊娠期母親被動(dòng)吸煙和尼古丁干預(yù)這兩種環(huán)境危險(xiǎn)因子是否影響胎兒的心臟發(fā)育及其功能。此外,運(yùn)用體外的擬胚體向心肌分化的細(xì)胞模型研究尼古丁在干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中如何通過影響DNA甲基化水平和心肌轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),并最終影響干細(xì)胞向心肌分化。 研究方法和結(jié)果 懷孕的Sprague-Dawley (SD)大鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組(相同體積的生理鹽水)、吸煙處理組(15和20支煙/天)和尼古丁處理組(15和20mg/kg/天)。在整個(gè)妊娠期,懷孕的母鼠分別每天給予15或20支煙被動(dòng)吸煙處理和15或20mg/kg尼古丁干預(yù)直至分娩(PND0),用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)子代新生乳鼠的心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能。超聲心動(dòng)圖M-mode圖像顯示妊娠期吸煙和尼古丁處理組的子代新生乳鼠的心臟跳動(dòng)的模式和頻率與對(duì)照組相似,也沒有出現(xiàn)異常的M-mode超聲心動(dòng)圖。心臟重量(F=0.655,P=0.636)和心臟重量/體重(F=1.149,P=0.4)在各處理組間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但多普勒檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,尼古丁處理組,新生乳鼠心臟的血流動(dòng)力學(xué)圖出現(xiàn)血流受限現(xiàn)象,而在20支煙/天處理組中則出現(xiàn)左右心室血流交錯(cuò)現(xiàn)象。 定量分析超聲心動(dòng)圖檢測(cè)所獲得的心功能指標(biāo),結(jié)果顯示：妊娠期母鼠給予20mg/kg/天尼古丁處理,子代新生乳鼠的左心室心肌質(zhì)量指數(shù)(Left Ventricular Mass, LV Mass),左心室收縮末期容量(LV end-systolic volume, LVESV),左心室舒張末期容量(LV end-diastolic volume, LVEDV)和左心室舒張末期后壁厚度(Diastolic left ventricular posterior wall, LVPW;d),與對(duì)照組相比均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LV Mass:14.85±2.26vs.29.91±2.52, P=0.000; LVESV:2.05±1.27vs.4.20±1.09,P=0.000; LVEDV:0.96±0.18vs.1.30±0.13, P=0.000; LVPW;d:0.44±0.06vs.0.53±0.07, P=0.01).20支煙/天尼古丁處理組,于對(duì)照組相比,LV Mass (21.28±2.49vs.29.91±2.52, P=0.000), LVESV (2.19±0.73vs.4.20±1.09, P=0.000), LVEDV (1.01±0.12vs.1.30±0.13P=0.001), LVPW;s0.45±0.06vs0.53±0.07, P=0.026)也顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 尼古丁和吸煙處理組的左心射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction, LVEF)和左心室短軸縮短率(Left ventricular fractional shortening, LVFS)與對(duì)照組相比,整體水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LVEF,F=8.117,P=0.000；LVFS,F:8.917,P=0.000),但是這兩個(gè)評(píng)價(jià)左心功能的重要指標(biāo)在吸煙和尼古丁干預(yù)后,不但沒有顯著下降,反而在20支煙/天處理組中較對(duì)照組上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LVEF,88.32±4.59vs78.86±7.24,P=0.001；LVFS,56.99±7.54vs45.83±7.04,P=0.000).上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明妊娠期孕鼠給予20支煙/天被動(dòng)吸煙處理或20mg/kg/天的尼古丁處理致后代的左心功能發(fā)生異常,且尼古丁和被動(dòng)吸煙干預(yù)產(chǎn)生一致的效應(yīng)。 為了進(jìn)一步研究尼古丁對(duì)心臟發(fā)育和心肌分化的影響,本研究用小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)制備成擬胚體并向心肌細(xì)胞分化的過程中給予一系列的尼古丁處理,其中包括低濃度(0.01-1pM)和高濃度(100-1000μM),用MTT法檢測(cè)其對(duì)干細(xì)胞增殖影響、PCR和Western blotting等方法檢測(cè)在分化過程中心肌轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。系列濃度梯度的尼古丁(0.01-1000μM),不影響懸滴法中擬胚體的形成,也不影響其形態(tài)和大小。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mESC在分化培養(yǎng)基中,前三天處于指數(shù)生長(zhǎng)期,培養(yǎng)第三天達(dá)到細(xì)胞增殖的高峰,第四天開始細(xì)胞增殖緩慢；說(shuō)明運(yùn)用懸滴法制備擬胚體的過程中,懸滴培養(yǎng)4天,細(xì)胞快速增殖形成擬胚體。有趣的是,在細(xì)胞增殖的高峰期(第3天),100μM尼古丁(P0.01).100μM尼古丁+100gM六烴季胺(P0.01)和100μM六烴季胺處理組(P0.05)比對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此效應(yīng)不能被六烴季胺阻斷,說(shuō)明該效應(yīng)與尼古丁乙酰膽堿受體無(wú)關(guān)。 經(jīng)3-D懸滴法培養(yǎng)后將擬胚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板中,在2-D的培養(yǎng)條件下進(jìn)一步貼壁分化和生長(zhǎng)。貼壁分化總共持續(xù)16天,期間給予系列濃度梯度的尼古丁處理�？瞻讓�(duì)照組的擬胚體在經(jīng)1周貼壁分化后,可以在顯微鏡下觀察到跳動(dòng)的細(xì)胞,而在分化的第12天跳動(dòng)的擬胚體的比例達(dá)到峰值。在尼古丁處理組(0.01-1000μM)跳動(dòng)的擬胚體比例均是在第14天達(dá)到最高峰,而比對(duì)照組推遲兩天。在分化的第12天,100μM尼古丁處理組,跳動(dòng)的擬胚體的比例比對(duì)照組下降了61.59%(13.38±5.44vs.74.97-11.28,P=0.000),而1000μM尼古丁處理組比對(duì)照組下降了66.52%(8.445±1.42vs.74.97±11.28,P=0.000)。因此,高濃度(100-1000μM)尼古丁作用抑制并推遲擬胚體向心肌細(xì)胞分化的過程。 心臟發(fā)育需要能促進(jìn)心肌細(xì)胞生成或抑制抗心肌細(xì)胞形成的核轉(zhuǎn)錄因子的作用。用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)分化第12天的擬胚體中轉(zhuǎn)錄因子的信使RNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示：小鼠胚胎干細(xì)胞干性維持基因Oct4和Nang,在尼古丁處理后,mRNA的相對(duì)表達(dá)量有增加的趨勢(shì),但是差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Oct4,F=0.313, P=0.863; Nanog, F=0.757, P=0.608)。相反,在100gM和1000μM尼古丁處理中,Tbx5和GATA4的mRNA表達(dá)水平比對(duì)照組均顯著降低(Tbx5,F=3.209, P=0.043; GATA4, F=9.043, P=0.000),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Western blot進(jìn)一步檢測(cè)Tbx5和GATA4在尼古丁處理后的擬胚體中的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示：尼古丁劑量依賴性的下調(diào)Tbx5和GATA4的蛋白表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tbx5,F=24.069,P=0.000; GATA4, F=9.303, P=0.001)。將獲得的蛋白條帶的灰密度值做相對(duì)定量分析,得到Tbx5和GATA4相對(duì)于看家基因GAPDH的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果再次顯示：給予0.01-1000gM尼古丁劑量依賴性的下調(diào)Tbx5和GATA4的蛋白表達(dá)水平,高濃度組(100和1000μM)尼古丁處理對(duì)這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用強(qiáng)烈。 為了進(jìn)一步闡明尼古丁對(duì)心肌分化的影響及相關(guān)的機(jī)制,實(shí)驗(yàn)中選用尼古丁乙酰膽堿受體拮抗劑,六烴季胺(Hexamethonium, Hexa),用于單獨(dú)或者和尼古丁共同作用于擬胚體的分化過程。采用免疫熒光染色法特異檢測(cè)經(jīng)分化的擬胚體中GATA4P日性細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)過4天懸滴培養(yǎng)(Day4)的擬胚體,在顯微鏡下無(wú)法觀察到跳動(dòng)的心肌細(xì)胞,但是免疫熒光可檢測(cè)到少量的GATA4陽(yáng)性細(xì)胞的存在。在第四天分化早期的擬胚體中,每組GATA4陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和大小相似,但是,經(jīng)過8天的貼壁分化(Day12),各組GATA4陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量顯著增加,并同時(shí)可觀察擬胚體中出現(xiàn)節(jié)律性跳動(dòng)的細(xì)胞。熒光顯微鏡鏡檢記錄的圖片顯示,在第12天的擬胚體中,與對(duì)照組相比,尼古丁處理降低GATA4陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量,六烴季胺和尼古丁共同處理則輕微增加GATA4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。 采用流式細(xì)胞儀定量分析GATA4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量,100μM尼古丁處理組GATA4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組顯著降低8.80%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(8.27±2.26%vs.17.07±3.18%,P=0.005)。分化12天的擬胚體中,100gM尼古丁和100gM六烴季胺共同處理組與尼古丁單獨(dú)處理組相比,GATA4細(xì)胞數(shù)量升高9.03%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(18.20±0.90%vs8.27±2.26%,P=0.003),說(shuō)明尼古丁的抑制效應(yīng)可被尼古丁乙酰膽堿受體拮抗劑部分阻斷。 用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)經(jīng)分化12天的擬胚體中相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平,單獨(dú)100μM尼古丁處理對(duì)Oct4和Tbx5mRNA的表達(dá)量的整體水平?jīng)]有差異(Oct4, F=2.335,P=0.150; Tbx5, F=0.996, P=0.455);而Nanog和GATA4的表達(dá)量在各組中整體水平差異顯著,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Nanog, F=5.273, P=0.027; GATA4, F=11.172, P=0.003)。Nanog的mRNA的表達(dá)量在尼古丁(100μM)和六烴季胺(1001μM)共同處理組比對(duì)照組顯著升高(2.40±0.90vs.00±0.30,P=0.015),與尼古丁單獨(dú)處理組相比也顯著升高(2.40±0.90vs.0.7±0.58,P=0.001),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尼古丁乙酰膽堿受體拮抗劑同樣也能阻斷尼古丁抑制心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA4表達(dá)的效應(yīng)：GATA4的mRNA表達(dá)量經(jīng)尼古丁處理后較對(duì)照組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.39±0.28vs.1.0±0.32,P=-0.035),然而尼古丁(100μM)和六烴季胺(100μM)共同處理組較對(duì)照組卻顯著升高(1.7±0.40vs.1.00±0.32,P=0.035),且與尼古丁單獨(dú)處理組相比也顯著升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.70±0.40vs.0.3±0.28,P=0.001)。 蛋白免疫印跡法獲得同上相似結(jié)果：尼古丁對(duì)GATA4的蛋白表達(dá)的抑制作用強(qiáng)烈而對(duì)Tbx5蛋白表達(dá)相對(duì)微弱。同樣的,尼古丁對(duì)上述兩個(gè)心肌轉(zhuǎn)錄因子蛋白水平的抑制作用可被尼古丁乙酰膽堿受體拮抗劑部分阻斷。以上結(jié)果都說(shuō)明尼古丁對(duì)心肌分化的抑制作用是通過抑制擬胚體分化過程中心肌轉(zhuǎn)錄因子的的mRNA和蛋白表達(dá)水平導(dǎo)致的,而且這種抑制效應(yīng)可以被尼古丁乙酰膽堿受體拮抗劑阻斷。 為了研究尼古丁在心肌分化早期的作用和機(jī)制,同時(shí)也進(jìn)一步探討其是否通過調(diào)控DNA甲基化的表觀遺傳學(xué)修飾作用來(lái)影響心肌重要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。本研究選用斑點(diǎn)雜交法(dot blot)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)經(jīng)12天分化的擬胚體中5-甲基胞嘧啶的表達(dá)水平并用western blot檢測(cè)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1和DNMT3B)的蛋白水平。 斑點(diǎn)雜交法結(jié)果顯示,分化的第12天的擬胚體經(jīng)尼古丁處理后,5-甲基胞嘧啶的表達(dá)顯著升高,但尼古丁和六烴季胺共同處理時(shí),其表達(dá)水平比尼古丁單獨(dú)處理組降低。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法定量檢測(cè)分化早期的擬胚體中5-甲基胞嘧啶的水平,該數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示：5-甲基胞嘧啶的表達(dá)水平在各處理組中差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.170,P=0.000),經(jīng)LSD方法多重比較結(jié)果顯示：經(jīng)尼古丁處理后,5-甲基胞嘧啶的水平比對(duì)照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(26.37±1.56vs.18.48±1.51,P=0.000),然而當(dāng)加入100μM六烴季胺和100μM尼古丁共同處理時(shí),其表達(dá)量比尼古丁單獨(dú)處理組卻顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義±(14.78±2.03vs.26.37±1.56, P=0.000)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法所得的結(jié)果不僅再次驗(yàn)證尼古丁干預(yù)顯著升高分化早期的擬胚體中5-甲基胞嘧啶的表達(dá)水平,也與前述dot blot的結(jié)果相一致,并進(jìn)一步顯示該抑制作用可以被尼古丁乙酰膽堿受體拮抗劑(六烴季胺)阻斷,提示該受體參與了上述過程。 為了進(jìn)一步研究尼古丁在擬胚體向心肌分化過程中,對(duì)DNA甲基化水平的影響,本實(shí)驗(yàn)采用western blot法檢測(cè)兩個(gè)重要的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1和DNMT3B)的蛋白表達(dá)水平。蛋白條帶灰密度分析結(jié)果顯示：DNMT1和DNMT3B的蛋白表達(dá)水平,在各處理組間差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(DNMT1: F=29.881, P=0.000; DNMT3B:F=26.651, P=0.000)。DNMT1和DNMT3B的蛋白表達(dá)水平,在尼古丁單獨(dú)處理組中比對(duì)照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(DNMT1,1.13±0.08vs.0.52±0.11,P=0.000; DNMT3B,0.36±0.06vs.0.20±0.02,P=0.001)；但在100μM尼古丁和100μM六烴季胺共同處理組中與單獨(dú)尼古丁組相比,兩者的表達(dá)水平均沒有差異(DNMT1,1.17±0.09vs.1.13±0.08,P=0.689; DNMT3,0.41±0.01vs.0.36±0.06,P=0.227)。 上述結(jié)果表明在擬胚體向心肌細(xì)胞分化的早期,尼古丁處理顯著的升高DNMT1和DNMT3B的蛋白表達(dá)水平,但當(dāng)同時(shí)加入尼古丁乙酰膽堿受體拮抗劑后,不能阻斷該效用,尼古丁對(duì)DNMT1和DNMT3B的促進(jìn)作用與對(duì)5-甲基胞嘧啶的作用是一致,提示在小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌分化過程中,尼古丁干預(yù)能顯著增加DNA甲基化水平。 結(jié)論 對(duì)體內(nèi)胚胎心臟發(fā)育模型的研究結(jié)果顯示,妊娠期持續(xù)給予吸煙和尼古丁處理誘發(fā)子代新生大鼠的心臟功能異常：孕期持續(xù)給予20支煙／天或者20mg/kg/天尼古丁干預(yù)顯著降低左心室心肌質(zhì)量指數(shù)(LV Mass),左心室收縮末期容量(LVESV),左心室舒張末期容量(LVEDV)和左心室舒張末期后壁厚度(LVPW;s)。 對(duì)體外擬胚體向心肌分化的細(xì)胞模型研究結(jié)果顯示,持續(xù)給予尼古丁處理選擇性抑制兩個(gè)心肌轉(zhuǎn)錄因子(Tbx5和GATA4)的mRNA和蛋白水平并降低GATA4陽(yáng)性的心肌祖細(xì)胞數(shù)量,從而抑制擬胚體向心肌細(xì)胞的分化。尼古丁對(duì)心肌分化的抑制作用可以被尼古丁乙酰膽堿受體抑制劑阻斷,提示該受體參與了尼古丁抑制心肌分化的過程并起重要作用。但尼古丁處理后卻能顯著提高5-甲基胞嘧啶和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTl和DNMT3B)的表達(dá)水平,暗示在擬胚體向心肌分化的早期,尼古丁升高DNA甲基化的水平,使相關(guān)的心肌轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平升高,從而抑制該基因的表達(dá)。 本研究結(jié)果首次揭示長(zhǎng)期、持續(xù)的吸煙和尼古丁干預(yù)抑制心臟的發(fā)育導(dǎo)致左心功能異常；在擬胚體向心肌分化過程中,尼古丁抑制心肌特異轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的同時(shí)上調(diào)DNA甲基化水平。本研究展示了先天性心臟病的環(huán)境危險(xiǎn)因子是如何通過影響遺傳因素和改變表觀遺傳學(xué)修飾作用,并最終誘導(dǎo)心臟發(fā)育異常；對(duì)CHD的病因和機(jī)制研究具有重要的意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R965

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1822216