本文選題：納米氧化鋁 + 自噬��； 參考：《山西醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：【目的】通過體外培養(yǎng)Wistar乳鼠皮質神經(jīng)元細胞，研究納米氧化鋁對神經(jīng)元細胞線粒體自噬的影響，初步探討線粒體自噬在納米氧化鋁致神經(jīng)元細胞損傷中的作用。 【方法】1.原代培養(yǎng)Wistar乳鼠皮質神經(jīng)元細胞，對其進行純度鑒定及細胞活力測定：（1）免疫組化法檢測原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞純度；（2）13nm氧化鋁0.5mmol/L染毒0、12、24和48h后，LDH法檢測培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶（LDH）活性。2.納米氧化鋁對神經(jīng)元細胞線粒體的損傷：（1）流式細胞儀檢測染毒不同時間后細胞內(nèi)線粒體膜電位（MMP）、活性氧（ROS）的變化情況；（2）透射電鏡（TEM）觀察納米氧化鋁對神經(jīng)元細胞線粒體超微結構的影響。3.納米氧化鋁致神經(jīng)元細胞自噬的檢測：（1）單丹酰戊二胺(MDC)熒光染色觀察染毒不同時間后細胞內(nèi)自噬小體的形成；（2）Western blot檢測自噬相關蛋白Beclin1、微管相關蛋白輕鏈3（LC3）Ⅱ/Ⅰ的表達；（3）自噬最明顯組加自噬抑制劑Spautin-1后自噬的變化情況。4.納米氧化鋁致神經(jīng)元細胞線粒體自噬的檢測及自噬抑制劑Spautin-1對神經(jīng)元細胞凋亡率的影響：（1）TEM觀察染毒后細胞內(nèi)自噬及線粒體自噬的超微結構；（2）溶酶體熒光探針Lysotracker和線粒體熒光探針Mitotracker共定位觀察溶酶體與線粒體的融合情況；（3）加抑制劑Spautin-1后，流式細胞術檢測細胞凋亡率的變化。 【結果】1.神經(jīng)元純度及納米氧化鋁對其活力的影響：（1）神經(jīng)元細胞經(jīng)免疫組化實驗純度鑒定95%以上屬于神經(jīng)元細胞；（2）與正常對照組相比，納米氧化鋁0.5mmol/L染毒12和24h后上清液中LDH活性均明顯增加（P0.05）,但隨著染毒時間的延長LDH活性呈下降趨勢，染毒48h下降到接近正常對照組水平。2.納米氧化鋁對神經(jīng)元細胞線粒體的損傷：（1）流式檢測活性氧結果顯示，染毒12h和24h組細胞內(nèi)活性氧水平均高于正常對照組，且具有統(tǒng)計學意義（P0.01），細胞內(nèi)活性氧水平呈上升趨勢，而在48h時有下降趨勢，且接近正常對照組水平；線粒體膜電位結果顯示，隨著染毒時間的延長，細胞內(nèi)線粒體膜電位呈下降趨勢，且均具有統(tǒng)計學意義（P0.01）；（2）細胞超微結構顯示，納米氧化鋁組線粒體分布不均勻并且出現(xiàn)變形、腫脹及空泡化，且隨著染毒時間的延長，，其損傷程度越嚴重。3.納米氧化鋁對神經(jīng)元細胞自噬的影響：（1）MDC對神經(jīng)元細胞進行熒光染色，可見正常對照組細胞幾乎沒有MDC熒光顆粒，而納米氧化鋁組有明顯的MDC熒光顆粒且隨著染毒時間的延長，MDC陽性熒光顆粒增加，加自噬抑制后MDC熒光顆粒減少；（2）與正常對照組相比，納米氧化鋁染毒不同時間后Beclin1蛋白表達水平呈上升趨勢且均具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平隨著染毒時間的延長呈上升趨勢且與正常對照組相比均有統(tǒng)計學意義（P0.05）。加自噬抑制劑后Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平均下降且有統(tǒng)計學意義（P0.05）。4.納米氧化鋁對神經(jīng)元細胞線粒體自噬的影響及自噬抑制劑Spautin-1對神經(jīng)元細胞凋亡率的影響：（1）電鏡圖顯示，正常對照組細胞器結構完整，沒有雙層膜包裹線粒體結構，而納米氧化鋁組受損的線粒體被雙層膜包裹形成線粒體自噬體的結構；（2）熒光共定位結果顯示對照組酸性溶酶體較少，僅見很少的線粒體與溶酶體融合的現(xiàn)象，而納米氧化鋁染毒組可見線粒體與溶酶體融合，且隨著染毒時間的延長，融合現(xiàn)象越來越明顯；（3）納米氧化鋁可使神經(jīng)元細胞凋亡率增加且具有統(tǒng)計學意義（P0.01），加入自噬抑制劑Spautin-1后凋亡率有所上升且具有統(tǒng)計學意義（P0.01），而抑制劑本身對細胞凋亡率沒有影響。 【結論】1.納米氧化鋁可致神經(jīng)元細胞線粒體損傷； 2.納米氧化鋁可引起神經(jīng)元細胞發(fā)生自噬； 3.受損的線粒體可能通過自噬（即線粒體自噬）作用清除，自噬可能通過降低細胞凋亡而對細胞起到一定的保護作用。
[Abstract]:[Objective] to study the effect of nano alumina on mitochondrial autophagy of neuronal cells by culture of Wistar rat cortical neurons in vitro, and to explore the role of mitochondrial autophagy in the neuronal cell injury induced by nano alumina.
[Methods] 1. primary cultured cortical neurons of Wistar rats were cultured, and their purity and cell viability were determined. (1) the purity of primary cultured neurons was detected by immunohistochemistry. (2) after 13nm alumina 0.5mmol/L was infected with 0,12,24 and 48h, LDH method was used to detect the lactic dehydrogenase (LDH) activity.2. nano alumina in the supernatant of the culture liquid. Damage of mitochondria in the cells: (1) flow cytometry was used to detect the mitochondrial membrane potential (MMP) and active oxygen (ROS) after exposure to different time. (2) transmission electron microscopy (TEM) observation of the effect of nano alumina on the ultrastructure of mitochondria of neuronal cells: detection of autophagy induced by.3. Nano-Al2O3 cells: (1) Dan Danxian Amyl two amine (MDC) fluorescence staining was used to observe the formation of autophagic corpuscles in cells after different time; (2) Western blot was used to detect autophagy related protein Beclin1, microtubule related protein light chain 3 (LC3) II / I; (3) autophagy was the most significant group with autophagy after the autophagy of autophagy,.4. nano alumina induced mitochondria in neuronal mitochondria Autophagy detection and the effect of autophagy inhibitor Spautin-1 on the apoptosis rate of neuron cells: (1) TEM observed the ultrastructure of autophagy and mitochondrial autophagy in the cells after exposure; (2) the fusion of lysosome and mitochondria was observed by the lysosomal fluorescent probe Lysotracker and the mitochondrial fluorescence probe Mitotracker; (3) adding inhibitor Spautin After -1, the apoptosis rate was detected by flow cytometry.
[results] the purity of 1. neurons and the effect of nano alumina on its vitality: (1) more than 95% of neuron cells were identified as neuron cells by immunohistochemistry. (2) the activity of LDH in the supernatant after 12 and 24h was significantly increased (P0.05) compared with the normal control group (P0.05), but with the prolongation of the time of exposure L The activity of DH decreased and the 48h decreased to the normal control group, which was close to the normal control group of.2. nano alumina. (1) the flow detection reactive oxygen species showed that the active oxygen water in the cells of the 12h and 24h groups was higher than the normal control group, and it was statistically significant (P0.01), and the intracellular active oxygen level was rising. The potential was decreased at 48h and was close to the normal control group, and the mitochondrial membrane potential showed that the mitochondrial membrane potential decreased with the prolongation of the exposure time, and all had statistical significance (P0.01). (2) the ultrastructure of the cells showed that the mitochondria in the nanomai Al2O3 group were unevenly distributed and swelled. And cavitation, and with the prolongation of time, the more serious the damage was, the effect of.3. nano alumina on the autophagy of neuron cells: (1) MDC was stained with fluorescence of neuron cells, and there were almost no MDC fluorescent particles in the normal control group, while the nano alumina group had obvious MDC fluorescent particles and with the prolongation of the time of exposure. MDC positive fluorescent particles increased and MDC fluorescent particles decreased after autophagic inhibition. (2) compared with the normal control group, the expression level of Beclin1 protein showed an upward trend and was statistically significant (P0.05). The expression level of LC3 II / I protein increased with the prolongation of the time of exposure and was compared with normal control. The results were statistically significant (P0.05). The expression levels of Beclin1 and LC3 II / I were decreased and the effects of.4. nano alumina on mitochondrial autophagy and the effect of autophagy inhibitor Spautin-1 on the apoptosis rate of neuron cells were statistically significant (P0.05): (1) a normal control group of organelles The structure of mitochondria was complete without a double layer membrane, and the damaged mitochondria in the nano alumina group were encapsulated by the double layer membrane to form the mitochondria autophagosome structure. (2) the fluorescence co localization results showed that the acid lysosomes were less in the control group, only a few mitochondria were fused with the lysosomes, and the nano alumina dyeing group could see the mitochondria. Fusion with lysosomes, and with the prolongation of exposure time, the fusion phenomenon is becoming more and more obvious. (3) nano alumina can increase the apoptosis rate of neuron cells and have statistical significance (P0.01). After adding autophagy inhibitor Spautin-1, the apoptosis rate has increased and has statistical meaning (P0.01), but the inhibitor itself has no shadow on the cell apoptosis rate. Ringing.
[Conclusion] 1. nano alumina can cause mitochondrial damage in neurons.
2. nano alumina can induce autophagy in neurons.
3. the damaged mitochondria may be eliminated by autophagy (mitochondrial autophagy). Autophagy may protect cells from apoptosis.

【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R994

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本文編號：1802047