本文選題：抗體偶聯(lián)藥物 + 前抗體　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：近年來(lái),抗體偶聯(lián)藥物(ADC)已在臨床腫瘤治療中展現(xiàn)出良好的治療效果。但是,針對(duì)EGFR靶點(diǎn)的抗體偶聯(lián)藥物的研發(fā)卻面臨著巨大挑戰(zhàn),其原因正是由于EGFR在人體內(nèi)分布較為廣泛,從腫瘤到正常組織如上皮組織的許多組織均有表達(dá)。前期,我們利用Pro-Antibody技術(shù)開發(fā)出針對(duì)EGFR靶點(diǎn)的前抗體,該抗體具有在腫瘤微環(huán)境中被特異性激活并靶向EGFR的特性,命名為PanP。在本研究中我們基于前期的成果,首次構(gòu)建并表達(dá)了針對(duì)EGFR靶點(diǎn)的前抗體偶聯(lián)藥物(pro-antibody-drug conjugate,PDC)PanP-DM1,簡(jiǎn)稱PDC。期望通過(guò)前抗體技術(shù)和抗體偶聯(lián)藥物這兩種技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用,使該P(yáng)DC既能獲得腫瘤組織EGFR位點(diǎn)的特異性結(jié)合活性,又能獲得比常規(guī)抗體更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng),降低抗EGFR抗體的皮膚毒性反應(yīng)。本課題在PDC藥物制備完成后首先使用SEC-UPLC、LC-MS等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了表征,并結(jié)合UV/VIS方法完成了DAR值的測(cè)定。SEC-UPLC結(jié)果顯示,我們制備的PDC純度在95%以上,與PanP相比無(wú)明顯差異;LC-MS對(duì)其脫糖后完整蛋白的分析結(jié)果也顯示,該P(yáng)DC精確分子量符合理論序列分子量,去卷積質(zhì)譜譜圖符合抗體偶聯(lián)藥物特征性多簇峰型結(jié)構(gòu),呈正態(tài)分布,以攜帶2~4個(gè)DM1為主;通過(guò)質(zhì)譜峰強(qiáng)度積分并且結(jié)合UV/VIS測(cè)定法對(duì)DAR值進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明我們制備的PDC其DAR值在4.2左右,符合常規(guī)ADC藥物的最佳藥物-抗體偶聯(lián)比例(Drug-antibody Ratio,DAR)。另外,我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,偶聯(lián)DM1之后的PDC藥物依然保持了能被腫瘤組織特異性酶(uPA)酶切激活的特性。在體外、體內(nèi)功能研究中,我們制備的新型PDC藥物也表現(xiàn)出比PanP更強(qiáng)的抗腫瘤活性,尤其是在小鼠移植瘤模型中,使用PDC抗體治療的實(shí)驗(yàn)組小鼠在治療結(jié)束后,腫瘤組織完全消除。為進(jìn)一步研究該P(yáng)DC藥物的抗腫瘤作用機(jī)制,我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),研究了細(xì)胞周期阻滯效應(yīng),結(jié)果表明PDC被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞后能在溶酶體的作用下釋放大量的微管抑制劑藥物——DM1,使細(xì)胞周期停滯在G2/M期,從而誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。最后我們還通過(guò)觀測(cè)小鼠體重減低情況對(duì)該藥物的非特異毒性(安全性)進(jìn)行了初步評(píng)估。通過(guò)本課題,我們構(gòu)建、表達(dá)并制備了一種新型的抗EGFR前抗體偶聯(lián)藥物——PanP-DM1,其不但具有腫瘤靶向特異性,而且具有增強(qiáng)的高腫瘤殺傷活性以及更好的安全性,從而具有良好的成藥性及臨床應(yīng)用前景。
[Abstract]:In recent years, antibody-coupled drug ADChas shown a good therapeutic effect in clinical tumor therapy. However, the development of antibody-coupled drugs targeting EGFR targets is facing great challenges. The reason is that EGFR is widely distributed in human body and is expressed in many tissues from tumor to normal tissue such as epithelial tissue. In the early stage, we developed a pre-antibody against EGFR target by using Pro-Antibody technique. The antibody was specifically activated in tumor microenvironment and targeted to EGFR, and was named PanP. In this study, we first constructed and expressed pro-antibody-drug conjugate drug PDC-PanP-DM1 (PDC-PanP-DM1) against EGFR targets. It is expected that the combined use of preantibody and antibody-coupled drugs will enable the PDC to obtain both the specific binding activity of EGFR sites in tumor tissues and the killing effect of tumor cells stronger than conventional antibodies. Reduce the skin toxicity of anti-EGFR antibody. SEC-UPLC- LC-MS and other techniques were used to characterize PDC drug preparation. The results of DAR determination of SEC-UPLC showed that the purity of PDC was over 95%. There was no significant difference between LC-MS and PanP in the analysis of the complete protein. The exact molecular weight of the PDC was in accordance with the theoretical molecular weight, and the deconvolution mass spectrogram was consistent with the characteristic multi-cluster structure of the antibody-coupled drugs, and showed a normal distribution. The results showed that the DAR value of our prepared PDC was about 4.2, which was in accordance with the best drug-antibody coupling ratio of conventional ADC drugs. In addition, our experimental data showed that the PDC drug could be activated by tumor tissue specific enzyme (UPA) digestion after coupling with DM1. In vitro and in vivo functional studies, our new PDC drug also showed stronger anti-tumor activity than PanP, especially in mice transplanted tumor model, the experimental group treated with PDC antibody after treatment. Tumor tissue was completely eliminated. In order to further study the anti-tumor mechanism of PDC, we studied cell cycle arrest by flow cytometry. The results showed that PDC could release a large amount of microtubule inhibitor DM1 after endocytosis by lysosome, resulting in cell cycle arrest in G _ 2 / M phase, thus inducing cell apoptosis. Finally, we evaluated the non-specific toxicity (safety) of the drug by observing the weight loss in mice. Through this study, we constructed, expressed and prepared a novel anti-preantibody coupling drug, PanP-DM1, which not only has tumor targeting specificity, but also has enhanced tumor killing activity and better safety. So it has good drug properties and clinical application prospect.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943

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