本文選題：石頭魚毒素 + neoVTX��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年碩士論文

【摘要】：能夠分泌蛋白類毒素的海洋生物種類繁多,主要包括腔腸動物門(如�？⑺傅�)、軟體動物門(如芋螺、海兔等)、棘皮動物(如海星、海膽等)、有毒魚類(如刺毒魚和毒腺魚)以及海蛇等。石頭魚(Synanceia)是海洋魚類中毒性最強的魚類之一,主要存在于太平洋和印度洋的熱帶水域。我國南海分布有玫瑰毒湁(Synanceia verrucosa),屬于刺毒魚中毒性最強的種類之一。石頭魚的背鰭、臀鰭和腹鰭分布有毒棘,背鰭棘兩側(cè)有毒囊,毒囊內(nèi)含有具有較強的致死性和溶血活性的毒素。被石頭魚的毒棘刺傷后,可產(chǎn)生劇烈疼痛、低血壓、水腫、惡心、頭暈、胸悶等癥狀,嚴重者出現(xiàn)呼吸和循環(huán)衰竭,甚至死亡。國外每年有數(shù)百例石頭魚刺傷的報道,我國也已報道了多例石頭魚毒素中毒的病例,并有較嚴重的癥狀如蜂窩織炎、組織壞死等發(fā)生。目前,海蛇、�？⑺敢约笆^魚毒素等中毒已有抗血清研究報道,部分已用于臨床。在石頭魚毒素的抗體制備方面,澳大利亞聯(lián)邦血清實驗室研制的石頭魚毒素抗毒血清,已用于石頭魚毒素中毒的治療。新加坡YUEN等利用從Synanceja horrida中提取的毒素Stonustoxin(SNTX)免疫Balb/C小鼠,制備了8株單克隆抗體,具有較高的抗體親和力和中和活性。由于國內(nèi)尚無石頭魚毒素的抗毒血清,石頭魚毒素中毒的治療主要是對癥和支持治療,如止痛、抗感染、抗休克和中醫(yī)中藥治療等。因此制備一種有效的抗毒素用于石頭魚毒素治療十分重要,發(fā)展其中毒的檢測方法也很有必要。對于蛋白質(zhì)類毒素的檢測方法目前研究較少,主要包括生物測試法、質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、基因分析方法、免疫分析方法及膠體金試紙快速檢測方法等。生物測試法是利用動物對毒素的敏感性來判斷毒素的性質(zhì),比較常用的是小鼠生物測試法和大鼠生物測試法。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)屬于高通量的蛋白質(zhì)分析技術(shù),可研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的作用及蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用,并可用于藥物的蛋白靶點篩選。質(zhì)譜分析技術(shù)的原理是將蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶消化后產(chǎn)生的一級質(zhì)譜峰圖和二級質(zhì)譜峰圖,與理論上相對應(yīng)的質(zhì)譜峰圖進行比對而鑒定蛋白質(zhì),目前該方法已廣泛應(yīng)用于海洋多肽及蛋白毒素的鑒定或分析。酶聯(lián)免疫分析方法是以抗原抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ),利用酶對底物的催化作用來進行的一種高靈敏度的檢測方法,具有高選擇性、檢測下限較低、操作簡單等特點。主要包括免疫熒光法、放射免疫法及酶聯(lián)免疫吸附試驗等三類。酶聯(lián)免疫吸附試驗方法等,不僅可以用于對抗原的檢測,也可以用于檢測抗體。膠體金檢測技術(shù)是利用膠體金的顯色性和與蛋白結(jié)合且不改變其生物活性的能力,屬于一項目快速檢測技術(shù),膠體金檢測試紙條檢測樣品一般只需數(shù)分鐘至幾十分鐘,操作簡便,目前在醫(yī)學(xué)、食品安全等領(lǐng)域具有十分廣泛的應(yīng)用。本實驗室前期從石頭魚的毒棘中提取了石頭魚毒素粗毒液,并分離純化了純毒素neovtx,克隆了neovtx的α和β亞基的cdna序列,并在原核細胞中成功表達了α亞基。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,開展neovtx大量制備,制備其鼠單抗及馬抗,然后采用酶聯(lián)免疫分析方法及膠體金技術(shù)分析血液中的neovtx,為石頭魚毒素的中毒診斷和治療奠定基礎(chǔ)。本論文主要結(jié)果如下:(1)制備了石頭魚毒素neovtx和具有很高抗毒活性的馬抗利用aktaprime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)對石頭魚毒素粗毒液進行大量分離純化,得到了neovtx純毒素322.6mg,純度達88.53%。分別用石頭魚毒素粗毒液和分離純化的組分neovtx免疫balb/c小鼠得到了較高的抗體滴度,并將neovtx交由公司分別進行鼠單抗和馬抗的制備。neovtx鼠單抗和馬抗的sds-page或凝膠色譜鑒定表明抗體純度較高(馬抗純度87.05%),鼠單抗(溶解于pbs至1mg/ml)的抗體滴度可達6400,馬抗血清的抗體滴度最高可達409600(濃度為40mg/ml)。neovtx鼠單抗對neovtx毒素的中和活性較差,體外給予3ld50的neovtx與30倍質(zhì)量的單抗(w/w)混合后靜脈注射未發(fā)現(xiàn)具有保護活性。而馬抗具有很好的保護活性,石頭魚粗毒液(4ld50):馬抗=1:2體外混合20min靜脈注射后小鼠可100%存活,neovtx(3ld50):馬抗=1:3體外混合20min靜脈注射后小鼠可100%存活。腹腔注射32ld50的neovtx30min后給予3倍質(zhì)量的馬抗尾靜脈注射,小鼠全部存活。(2)酶聯(lián)免疫分析方法可靈敏檢測血液中的neovtx首先利用簡易過碘酸鈉法將neovtx馬抗與辣根過氧化物酶(hrp)偶聯(lián),得到馬抗-hrp偶聯(lián)物。通過逐步試驗探索最佳的實驗條件,測定了馬抗的最佳包被濃度、馬抗-hrp最佳濃度,建立了pbs溶液中的雙抗體夾心elisa檢測方法及標準曲線。該方法在pbs溶液中的線性回歸方程為y=1.676x-1.140(r2=0.9728,n=8,p0.0001),線性范圍為4-512ng/ml。但人血漿中neovtx樣品的od值顯著低于同等濃度neovtx在pbs溶液中的od值,其在人血漿中的檢測標準曲線的線性回歸方程為y=0.3094x-0.1208(r2=0.9907,n=10,p0.0001),線性范圍為4-2048ng/ml。該方法靈敏度高,在pbs和血漿中檢測靈敏度均可達4ng/ml,并具有較好的特異性和重復(fù)性。(3)建立了neovtx的膠體金檢測方法以氯金酸為原料,利用檸檬酸三鈉還原法制備了6種不同粒徑的膠體金溶液,利用紫外可見光分光光度計及電鏡法證實膠體金制備成功。通過實驗確定膠體金標記的最佳pH值為8.0,1 ml膠體金溶液的最佳馬抗標記量為96μg,利用膠體金與石頭魚毒素馬抗結(jié)合,制備了金標馬抗,經(jīng)初步實驗驗證金標馬抗制備成功。在此基礎(chǔ)上,通過實驗確定了合適的膠體金層析材料:NC膜選擇Millipore135型,膠體金墊選擇GL 0194型,樣品墊選擇GL-b01型,吸水濾紙為H 5076型。各條帶的最佳點樣濃度分別為:C線為羊抗馬IgG稀釋45倍,T線濃度為馬抗稀釋至4 mg/ml,膠體金墊最佳濃度為金標馬抗液稀釋2倍后每墊滴加15μl。通過不斷優(yōu)化實驗條件,成功制備了石頭魚毒素膠體金檢測試紙。該檢測試紙條靈敏度較高,檢測限可達100 ng/ml左右,該試紙條特異性較強,對BSA、卵清蛋白及水母毒素等無非特異性反應(yīng)出現(xiàn)。
[Abstract]:A variety of marine organisms capable of secreting proteins such as sea anemones , jellyfish , etc . , soft body doors ( such as sea star , sea rabbit , etc . ) , toxic fish ( such as sea star , sea urchins , etc . ) , toxic fish ( such as sea star , sea urchins , etc . ) , toxic fish ( such as sea star , sea snake , etc . ) , toxic fish ( such as poison fish and poisonous gland fish ) and sea snake have been reported . This paper deals with the determination of toxin by using the method of enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) , radioimmunoassay and enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) . The results showed that the optimum pH value of the colloidal gold was 8.0 , the optimal concentration of horse anti - hrp was 4 - 512ng / ml .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R996.3

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本文編號：1773756