本文選題：芳香烴受體 + AhR核易位體蛋白��； 參考：《內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:本研究擬探討在不同濃度的BaP處理下,采用CoCl2作為HIF-1α的激動(dòng)劑,在A549細(xì)胞中基于FRET技術(shù)研究AhR、HIF-1α與ARNT的相互作用,以期對(duì)這兩條重要的信號(hào)通路之間關(guān)系的研究提供一定的參考,為科學(xué)家們尋找阻斷AhR和HIF-1信號(hào)通路的藥物來(lái)預(yù)防和治療癌癥提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)利用分子克隆基因重組技術(shù)獲得目的質(zhì)粒:從A549細(xì)胞中提取總RNA,采用RT-PCR法克隆目的基因AhR、ARNT片段,通過(guò)質(zhì)粒載體的構(gòu)建將兩個(gè)目的基因AhR和ARNT分別重組到熒光表達(dá)載體質(zhì)粒pAcGFP1-N1和pDsRed-Monomer-N1上,得到pAcGFP1-N1-AhR和pDsRed-Monomer-N1-ARNT兩個(gè)重組質(zhì)粒。(2)利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究AhR、HIF-1α與ARNT的相互作用:pAcGFP1-N1-AhR是目的基因Ah R與GFP融合表達(dá),而pDsRed-Monomer-N1-ARNT是ARNT與pDsRed-Monomer-N1融合表達(dá)。檢測(cè)AhR與ARNT是否發(fā)生了相互作用,就等同于檢測(cè)pAcGFP1-N1和pDsRed-Monomer-N1是否發(fā)生了FRET。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)介導(dǎo)pAcGFP1-N1-AhR和pDsRed-Monomer-N1-ARNT兩個(gè)重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中的表達(dá),用不同濃度的BaP(0μM、2μM、4μM、8μM,作用24h)和CoCl2(300μM,作用24h)處理A549細(xì)胞,運(yùn)用高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)的熒光成像模塊,研究在A549細(xì)胞中用CoCl2激動(dòng)HIF-1α進(jìn)入核內(nèi)時(shí),根據(jù)熒光重組質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度的變化情況,判斷AhR與HIF-1α是否競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ARNT。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建pAcGFP1-N1-AhR和pDsRed-Monomer-N1-ARNT兩個(gè)重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定和DNA序列測(cè)定鑒定載體構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后pDsRed-Monomer-N1-ARNT和pAcGFP1-N1-AhR兩個(gè)重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中成功表達(dá),轉(zhuǎn)染率分別為15%和19%。(2)在細(xì)胞質(zhì)中可觀察到綠色熒光信號(hào),在細(xì)胞核中可觀察到紅色熒光信號(hào),表明這兩種重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中成功表達(dá)。此外,我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核中可檢測(cè)到FRET熒光信號(hào),表明AhR與ARNT在核內(nèi)發(fā)生相互作用。(3)用不同濃度的BaP(0μM、2μM、4μM、8μM,作用24h)處理轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中的pAcGFP1-N1-AhR和pDsRed-Monomer-N1-ARNT兩個(gè)重組質(zhì)粒,FRET熒光信號(hào)強(qiáng)度與對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)且呈劑量依賴性,當(dāng)BaP濃度為8μM時(shí),FRET熒光信號(hào)強(qiáng)度約為對(duì)照組的2.3倍,且差異具有顯著性(P0.05)。(4)加入300μM CoCl2和BaP 8μM處理24h后,FRET熒光信號(hào)強(qiáng)度與只加BaP 8μM,作用24h相比明顯減弱,處理組的熒光信號(hào)強(qiáng)度為之前的0.6倍。結(jié)論:BaP能上調(diào)pAcGFP1-N1-AhR和pDsRed-Monomer-N1-ARNT兩個(gè)重組質(zhì)粒的FRET熒光信號(hào)并呈劑量依賴性;CoCl2處理后FRET熒光信號(hào)強(qiáng)度減弱說(shuō)明HIF-1α競(jìng)爭(zhēng)AhR結(jié)合ARNT蛋白,進(jìn)一步說(shuō)明HIF-1α信號(hào)通路的激活抑制AhR信號(hào)通路。
[Abstract]:Aim: to investigate the interaction between AhRHIF-1 偽 and ARNT in A549 cells by using CoCl2 as an agonist of HIF-1 偽 in A549 cells treated with different concentrations of BaP.In order to provide a certain reference for the study of the relationship between these two important signal pathways and provide some experimental basis for scientists to find drugs to block the AhR and HIF-1 signaling pathways to prevent and treat cancer.Methods the target plasmid was obtained by molecular cloning gene recombination technique: total RNAs were extracted from A549 cells, and the target gene AhRRARNT fragment was cloned by RT-PCR method.The two target genes, AhR and ARNT, were recombined into the fluorescent expression vector pAcGFP1-N1 and pDsRed-Monomer-N1 by construction of plasmid vector.Two recombinant plasmids, pAcGFP1-N1-AhR and pDsRed-Monomer-N1-ARNT, were obtained. The fluorescence resonance energy transfer technique was used to study the interaction between HIF-1 偽 and ARNT: pAcGFP1-N1-AhR is the fusion expression of the target gene Ah R and GFP, while pDsRed-Monomer-N1-ARNT is the fusion expression of ARNT and pDsRed-Monomer-N1.Detecting whether AhR interacts with ARNT is equivalent to detecting whether pAcGFP1-N1 and pDsRed-Monomer-N1 have fret.The expression of pAcGFP1-N1-AhR and pDsRed-Monomer-N1-ARNT in A549 cells was mediated by liposome transfection technique. A549 cells were treated with different concentrations of BaP(0 渭 MU 2 渭 MU 8 渭 M for 24 h) and CoCl2(300 渭 M for 24 h. The fluorescent imaging module of high intension cell screening system was used.In A549 cells, CoCl2 was used to stimulate HIF-1 偽 into the nucleus. According to the change of fluorescence intensity of the recombinant plasmid, the competitive binding of AhR and HIF-1 偽 was determined.Results two recombinant plasmids, pAcGFP1-N1-AhR and pDsRed-Monomer-N1-ARNT, were successfully constructed. The recombinant plasmids pDsRed-Monomer-N1-ARNT and pAcGFP1-N1-AhR were successfully expressed in A549 cells after transfection.The transfection efficiencies were 15% and 19%, respectively. Green fluorescence signals were observed in the cytoplasm and red fluorescence signals were observed in the nucleus, indicating that the two recombinant plasmids were successfully expressed in A549 cells.In addition, we found that FRET fluorescence signals could be detected in the nucleus.The results showed that the fluorescence signal intensity of pAcGFP1-N1-AhR and pDsRed-Monomer-N1-ARNT recombinant plasmids transfected into A549 cells was enhanced in a dose-dependent manner with different concentrations of BaP(0 渭 MU 2 渭 MU 4 渭 M + 8 渭 M and 24 h. The fluorescence signal intensity of pAcGFP1-N1-AhR and pDsRed-Monomer-N1-ARNT recombinant plasmids transfected into A549 cells was increased in a dose-dependent manner.When the concentration of BaP was 8 渭 M, the fluorescence signal intensity of fret was about 2.3 times of that of the control group, and the difference was significant (P 0.05). The intensity of fret fluorescence signal was significantly decreased after the addition of 300 渭 M CoCl2 and 8 渭 M BaP for 24 h, compared with that of BaP 8 渭 M alone for 24 h.The intensity of fluorescence signal in the treatment group was 0.6 times higher than that in the previous treatment group.Conclusion FRET fluorescence signal of pAcGFP1-N1-AhR and pDsRed-Monomer-N1-ARNT can be upregulated by% bap and the intensity of FRET fluorescence signal is decreased in a dose-dependent manner after treatment with CoCl2, which indicates that HIF-1 偽 competes with ARNT protein and further indicates that the activation of HIF-1 偽 signaling pathway inhibits AhR signaling pathway.
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R91

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本文編號(hào)：1773715