發(fā)布時(shí)間：2018-04-19 02:33

  本文選題：表皮生長(zhǎng)因子受體 + 二聚體界面　； 參考：《廣東藥學(xué)院》2014年碩士論文

【摘要】：表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）是HER家族的主要成員之一，是一類跨膜糖蛋白，由胞外域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)域三個(gè)區(qū)域組成，胞外域含配體結(jié)合區(qū)，胞內(nèi)域含有酪氨酸激酶活性區(qū)。目前已發(fā)現(xiàn)約30%的上皮癌為EGFR過表達(dá)，其中包括非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、卵巢癌和胃癌等，且該類表型的腫瘤患者預(yù)后差、轉(zhuǎn)移快、對(duì)放療與化療抗拒和生存期較短。因此，EGFR是上皮癌治療的理想靶分子，也是國(guó)際上第一個(gè)惡性腫瘤治療分子靶。針對(duì)EGFR胞外域的單克隆抗體和作用于胞內(nèi)域酪氨酸激酶抑制劑屬于抗EGFR腫瘤新藥研發(fā)的最熱門的兩大領(lǐng)域，然而統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在臨床上僅有10-30%的EGFR陽性患者對(duì)該類藥物有反應(yīng)。盡管原因復(fù)雜多樣，腫瘤患者EGFR胞外域及胞內(nèi)域發(fā)生缺失或突變是目前治療策略失效的主要原因之一。對(duì)于EGFR家族來講，在絕大多數(shù)情況下“二聚化”是受體活化（磷酸化）必須經(jīng)歷的途徑，而參與二聚體形成的“界面區(qū)域”暴露則是二聚體形成的必要條件。因此，我們認(rèn)為，采取“二聚化靶向”策略，能夠有效提高EGFR腫瘤治療措施的臨床反應(yīng)率和療效。單克隆抗體是針對(duì)特定單一抗原決定簇產(chǎn)生的抗體，能特異性結(jié)合、殺傷靶細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)擬以實(shí)驗(yàn)室前期工作中分離鑒定的一個(gè)EGFR的B細(xì)胞表位肽—EGFR267-297為抗原，通過免疫原性分析確定最佳免疫原構(gòu)建形式，制備一類鼠源性靶向EGFR二聚體界面區(qū)的單克隆抗體，評(píng)價(jià)體外抑瘤活性及分析其生物學(xué)特性，為以后單克隆抗體人源化改造及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下良好基礎(chǔ)。 方法： 1比較四種不同EGFR267-297構(gòu)建形式免疫肽的免疫原性 戊二醛偶聯(lián)法得到偶聯(lián)肽BSA*EGFR267-297和OVA*EGFR267-297，將實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的兩種融合肽MVF-EGFR267-297，P64K-EGFR267-297和偶聯(lián)肽P64K*EGFR267-297與本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的偶聯(lián)肽BSA*EGFR267-297作為免疫原免疫Balb/c小鼠，以O(shè)VA*EGFR267-297作為檢測(cè)抗原用間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)，選用最高效價(jià)的構(gòu)建形式作為制備單克隆抗體的免疫原。 2制備EGFR二聚化界面單克隆抗體 用免疫原性最高的免疫原免疫Balb/c小鼠，ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)。用常規(guī)方法建立單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，腹腔注射Balb/c小鼠得到腹水型單抗，用PEG6000沉淀法及Protein A柱純化單抗， ELISA法檢測(cè)腹水型單抗效價(jià)，并進(jìn)行親和力常數(shù)測(cè)定和單抗亞類、輕鏈鑒定。 3單抗體外抑瘤效果分析 MTT法檢測(cè)EGFR267-297mAb對(duì)EGFR過表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231以及EGFR正常表達(dá)的小鼠成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞增殖抑制。 4單抗生物學(xué)特性分析 用流式細(xì)胞術(shù)分析單抗誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率；用激光共聚集法觀察單抗誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；激光共聚集法觀察EGFR267-297mAb與EGFR過表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞及LLC細(xì)胞表面結(jié)合與內(nèi)化。 結(jié)果： 1比較四種不同EGFR267-297構(gòu)建形式免疫肽的免疫原性 四種免疫原中以BSA*EGFR267-297免疫原性最高，所以選用它作為制備單克隆抗體的免疫原，以O(shè)VA*EGFR267-297作為檢測(cè)抗原，排除背景。 2制備EGFR267-297單克隆抗體 常規(guī)雜交瘤手段制備6株高效價(jià)穩(wěn)定分泌的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，單抗純化后純度可達(dá)95%，重鏈約50kDa，輕鏈約25kDa與文獻(xiàn)報(bào)道一致，單抗效價(jià)最高者超過1：2560000，單抗選用其中四株高效價(jià)的單抗測(cè)定親和力均屬高親和力單抗（K㧐1089），單抗亞類、輕鏈鑒定結(jié)果顯示3株為IgG1，1株為IgG2a，輕鏈都為Kappa。 3單抗體外抑瘤效果分析 EGFR267-297mAb(200μg/ml)、西妥昔單抗陽性對(duì)照組對(duì)MM-231細(xì)胞的增殖抑制率分別是29.37%及31.60%，，3T3細(xì)胞的增殖抑制率分別是4.85%及3.93%，說明對(duì)EGFR267-297mAb對(duì)EGFR過表達(dá)的惡性腫瘤細(xì)胞有明顯抑制作用且對(duì)正常細(xì)胞的副作用較小，抑制率與上市藥物西妥昔單抗接近。 4單抗生物學(xué)特性分析 流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明EGFR267-297mAb高中低三個(gè)濃度梯度誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞早期凋亡率分別為：41.3%、43.7%、57.4%，晚期凋亡率分別為：20.8%、28.6%、13.4%，總凋亡率分別為：62.1%、72.3%、70.8%，比西妥昔陽性組的凋亡率更高。用激光共聚集法觀察單抗誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞染色質(zhì)明顯皺縮，周邊化，周圍有顆粒狀的散在點(diǎn)；激光共聚集法觀察EGFR262-292mAb能特異性地結(jié)合到MM-231細(xì)胞及LLC細(xì)胞表面并內(nèi)化。 結(jié)論： 成功制備6株靶向EGFR二聚體界面能夠穩(wěn)定分泌的高效價(jià)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，制備的單抗對(duì)EGFR過表達(dá)細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，并能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且在體外能特異性地與EGFR過表達(dá)細(xì)胞結(jié)合，為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下良好基礎(chǔ)。
[Abstract]:The epidermal growth factor receptor ( EGFR ) is one of the main members of HER family . It is a kind of transmembrane glycoprotein composed of extracellular domain , transmembrane region and intracellular domain .

Method :

Comparison of immunogenicity of four different EGFR267 - 297 constructs

鎴婁簩閱涘伓鑱旀硶寰楀埌鍋惰仈鑲紹SA*EGFR267-297鍜孫VA*EGFR267-297,灝嗗疄楠屽涔嬪墠鏋勫緩鐨勪袱縐嶈瀺鍚堣偨MVF-EGFR267-297,P64K-EGFR267-297鍜屽伓鑱旇偨P64K*EGFR267-297涓庢湰瀹為獙鏋勫緩鐨勫伓鑱旇偨BSA*EGFR267-297浣滀負(fù)鍏嶇柅鍘熷厤鐤獴alb/c灝忛紶,浠VA*EGFR267-297浣滀負(fù)媯

本文編號(hào)：1771213