本文選題：肝細(xì)胞生長因子HGF + 激酶　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：肝細(xì)胞生長因子受體(hepatocyte growth factor receptor, HGFR),又稱c-Met (mesenchymal-epithelial transition, MET),是在80年代發(fā)現(xiàn)的原癌基因產(chǎn)物,現(xiàn)已確定為受體酪氨酸激酶家族中的成員。HGF最初是作為大鼠肝細(xì)胞絲裂原(mitogen)而被發(fā)現(xiàn),其作用與擴(kuò)散因子(scatter factor)相似�，F(xiàn)已證明,HGF主要由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,通過其受體c-Met,能刺激上皮細(xì)胞等細(xì)胞的增殖,運(yùn)動(dòng),形態(tài)發(fā)生(morphogenesis)和血管生成。 在正常生理情況下,HGF與受體c-Met結(jié)合導(dǎo)致受體激酶區(qū)的酪氨酸發(fā)生磷酸化,進(jìn)而導(dǎo)致受體及其下游信號(hào)通路的激活,在維持機(jī)體器官的發(fā)育和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用。然而,HGF異常分泌,c-Met突變,擴(kuò)增(amplification)以及高表達(dá)導(dǎo)致的c-Met通路的異常激活,可引起c-Met受體的持續(xù)激活與磷酸化,從而持續(xù)不斷地激活下游信號(hào)通路,導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖,誘導(dǎo)正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 有許多方法用來抑制異常的HGF/c-Met信號(hào)通路,包括：HGF環(huán)狀異構(gòu)體拮抗劑(HGF variant antagonist),HGF抗體拮抗劑(HGF antibody antagonist), c-Met抗體拮抗劑(c-Met antibody antagonist)以及小分子c-Met抑制劑。目前發(fā)現(xiàn)的小分子c-Met抑制劑絕大多數(shù)都是作用在受體酪氨酸激酶的抑制劑。絕大多數(shù)化合物都通過與c-Met受體激酶區(qū)ATP口袋(ATP binding site)結(jié)合,抑制酪氨酸殘基的磷酸化,抑制c-Met通路持續(xù)異常激活導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞異常增殖和生長。 間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)是胰島素受體酪氨酸激酶家族成員之一。ALK在腫瘤中的異常改變主要是基因移位,異常的移位導(dǎo)致許多ALK融合蛋白(ALK fusion protein)產(chǎn)生,并持續(xù)激活A(yù)LK,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖和生長。同時(shí)抑制c-Met和ALK已經(jīng)證明在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤細(xì)胞中有協(xié)同效應(yīng)。因此,研究同時(shí)作用于c-Met和ALK的雙重激酶抑制劑(c-Met/ALK dual inhibitor)是非常有前景的抗腫瘤藥物。美國FDA于2011年批準(zhǔn)了c-Met/ALK雙重抑制劑克唑替尼(Crizotinib)用于治療有EML4-ALK融合蛋白形成的非小細(xì)胞肺癌患者。 雖然c-Met和ALK的雙重激酶抑制劑是非常有前景的抗腫瘤策略,但在文獻(xiàn)中報(bào)道的此類抑制劑很少,除Crizotinib外,還有一個(gè)是Xcovery公司研發(fā)的X-396,目前在進(jìn)行一期臨床試驗(yàn)。我們實(shí)驗(yàn)室多年來一直開展c-Met抑制劑的研究,本論文是在實(shí)驗(yàn)室前期的工作基礎(chǔ)上,綜合文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果以及臨床上應(yīng)用c-Met/ALK雙重抑制劑克唑替尼(Crizotinib)成功的策略,設(shè)計(jì)和合成新的作用于c-Met和ALK的化合物,旨在發(fā)現(xiàn)新的高活性和高選擇性的c-Met/ALK雙重抑制劑。 主要的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一.SMU系列螺環(huán)化合物的設(shè)計(jì)與合成以及分子對(duì)接模擬 在我們實(shí)驗(yàn)室之前有關(guān)c-Met抑制劑的研發(fā)中,發(fā)現(xiàn)了一類螺環(huán)化合物是有效的高選擇性c-Met抑制劑,這些化合物分子中的螺環(huán)片段能很好地適應(yīng)c-Met的ATP結(jié)合口袋,而c-Met/ALK雙重抑制劑克唑替尼分子中含有典型的激酶鉸鏈區(qū)結(jié)合基團(tuán),即2-氨基吡啶。據(jù)此,我們的設(shè)計(jì)思路是：將螺環(huán)片斷與激酶鉸鏈區(qū)結(jié)合基團(tuán)2-氨基吡啶片斷結(jié)合成一個(gè)新的化合物,可能同時(shí)具有c-Met/ALK的雙重阻斷作用?因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了3-位由帶手性取代基的芐氧基取代的2-氨基吡啶化合物SMU-A及SMU-B;考慮到2-氨基吡嗪基與2-氨基吡啶基的相似性,又設(shè)計(jì)了毗嗪化合物SMU-C及SMU-D。上述四個(gè)化合物分子中都具有一個(gè)手性基團(tuán),化學(xué)合成難度高。為了減小化學(xué)合成的難度,我們除去3-位取代芐氧基中的手性甲基再設(shè)計(jì)了非手性化合物SMU-E及SMU-F。 然后,我們對(duì)設(shè)計(jì)的化合物與c-Met激酶晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分子對(duì)接模擬,發(fā)現(xiàn)這些化合物都能與激酶晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接。6個(gè)化合物根據(jù)Surflex-Dock程序的打分值依次如下：8.68,8.67,9.11,8.95,6.70和6.91,克唑替尼為8.67。以化合物SMU-B為例,c-Met激酶的ATP口袋能夠很好地接納SMU-B,并與其形成多個(gè)包括氫鍵、π-π堆積作用、范德華力等相互作用。在c-Met激酶晶體結(jié)構(gòu)中,SMU-B能與克唑替尼很好地疊合,除了靠近溶劑區(qū)的部分,SMU-B與克唑替尼幾乎達(dá)到完美的重疊一致。此外,SMU-B也能與ALK激酶晶體結(jié)構(gòu)的ATP口袋很好地對(duì)接。由此預(yù)測(cè),SMU-B應(yīng)該具有對(duì)c-Met和ALK激酶的雙重抑制作用。于是,我們合成了六個(gè)SMU系列的螺環(huán)化合物擬進(jìn)行下一步的研究。 二.SMU系列螺環(huán)化合物對(duì)c-Met和ALK激酶高選擇性活性的確認(rèn) 為了驗(yàn)證上述計(jì)算機(jī)分子模擬的結(jié)果,我們首先檢測(cè)了化合物對(duì)細(xì)胞中c-Met激酶活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),六個(gè)化合物對(duì)MKN45胃癌細(xì)胞中c-Met激酶有顯著抑制活性,IC50值依次為0.020,0.019,0.023,0.012,10和9.0μM,克唑替尼為0.020gM,與計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模擬的預(yù)測(cè)一致。進(jìn)一步對(duì)上述化合物的生物利用度研究結(jié)果表明,SMU-B的口服生物度達(dá)到48%,因此確定該化合物進(jìn)入下一步研究。 首先采用美國KINOMEscanTM公司的激酶高通量篩選技術(shù),評(píng)價(jià)了SMU-B對(duì)人96種蛋白激酶生化活性的影響,發(fā)現(xiàn)SMU-B在100nM濃度下僅對(duì)c-Met,ALK和AXL三種受體酪氨酸激酶活性有顯著的抑制活性,抑制率分別為94.4%,91.2%和95.4%,表明SMU-B對(duì)受體酪氨酸激酶家族的c-Met、ALK和AXL三種蛋白激酶表現(xiàn)出高選擇性。然后,采用美國Reaction BiologyCorporation的放射蛋白激酶活性檢測(cè)方法進(jìn)一步測(cè)定了SMU-B對(duì)三種激酶生化活性抑制的IC50值。結(jié)果表明,SMU-B對(duì)c-Met, ALK和AXL三種激酶生化活性都有顯著的抑制作用。在激酶底物ATP的存在下,c-Met酶生化活性抑制的IC50值為1.87nM,ALK的IC50值0.5nM, AXL的IC50值為28.9nM。SMU-B對(duì)三種激酶抑制活性的強(qiáng)度以ALK最強(qiáng),其次為c-Met, AXL最弱。最后,我們選擇c-Met擴(kuò)增的人胃癌MKN45細(xì)胞,ALK激活的人T淋巴瘤Karpas299細(xì)胞和AXL高表達(dá)的鼠胚胎成纖維MEF細(xì)胞來分別評(píng)價(jià)SMU-B對(duì)細(xì)胞中c-Met, ALK和AXL三種激酶的抑制活性,結(jié)果表明化合物對(duì)MKN45細(xì)胞c-Met磷酸化抑制的IC50為22nnM,對(duì)Karpas299淋巴瘤細(xì)胞ALK磷酸化抑制的IC50為39nM,對(duì)MEF鼠胚胎成纖維細(xì)胞AXL磷酸化抑制的IC50為300nM；而陽性化合物克唑替尼對(duì)MKN45細(xì)胞c-Met磷酸化抑制的IC50為20nM,對(duì)Karpas299細(xì)胞ALK磷酸化抑制的IC50為110nM,高于SMU-B的39nM。SMU-B對(duì)上述三個(gè)激酶細(xì)胞活性的作用與生化活性結(jié)果一致。而SMU-B對(duì)AXL細(xì)胞磷酸化抑制的ICso為300nM,遠(yuǎn)高于生化活性的28.9nM,進(jìn)一步證明了該化合物對(duì)AXL激酶活性弱,為高選擇性c-Met/ALK雙重抑制劑。 三.SMU-B抑制體外培養(yǎng)的c-Met異常的人腫瘤細(xì)胞的增殖和生長我們采用MTT法研究了SMU-B在體外對(duì)四種c-Met異常的人腫瘤細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)化合物在體外能顯著抑制c-Met擴(kuò)增的人胃癌GTL-16細(xì)胞,c-Met擴(kuò)增的人肺癌H1993細(xì)胞,c-Met高表達(dá)人肺癌H441細(xì)胞以及有HGF自分泌功能的人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的增殖和生長,對(duì)GTL-16細(xì)胞生長抑制的IC50值為0.020gM,對(duì)H1993的IC50值為1.58gM,對(duì)H441的IC50值為2.02-tM,但對(duì)腦膠質(zhì)瘤U87MG的生長抑制作用較弱,抑制的IC5010μM。上述SMU-B在體外抗c-Met異常細(xì)胞增殖的篩選結(jié)果為下一步體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)提供了初步的依據(jù)。 四.SMU-B抑制c-Met異常的人GTL-16胃癌,U87MG腦膠質(zhì)瘤和H441肺癌裸鼠異體移植瘤的生長 根據(jù)體外抗增殖作用的結(jié)果,我們采用腫瘤異體移植裸鼠模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)了SMU-B對(duì)c-Met擴(kuò)增的人胃癌GTL-16細(xì)胞,c-Met高表達(dá)的人肺癌H441細(xì)胞以及有HGF自分泌功能的人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的生長抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SUM-B雖然對(duì)上述三種c-Met異常的人腫瘤裸鼠異體移植瘤都有顯著的抗腫瘤作用,但在裸鼠體內(nèi)的作用與體外抗增殖結(jié)果不完全一致。SMU-B以20mg/kg口服灌胃給藥一日一次連續(xù)14天,GTL-16胃癌的抑瘤率為56.6%,當(dāng)劑量增加至40mg/kg時(shí),抑瘤率增加至84.8%；在相同劑量下,對(duì)H441的抑瘤率分別為58.9%和78.7%,對(duì)U87MG的抑瘤率分別為60.7%和92.3。SMU-B在體外抑制U87MG細(xì)胞增殖的IC50值101.tM,高于GTL-16和H441細(xì)胞,但在裸鼠體內(nèi)的抑瘤作用卻比二者好。 五.SMU-B抑制HGF誘導(dǎo)的人肺癌A549細(xì)胞的遷移和侵襲作用 由于HGF/c-Met具有增加腫瘤細(xì)胞移動(dòng)和侵襲的能力,我們以外源性HGF誘導(dǎo)c-Met激活的人A549肺癌細(xì)胞為模型,研究SMU-B對(duì)HGF誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的遷移和侵襲的影響。A549細(xì)胞在正常條件下表達(dá)低水平的c-Met,僅在外源性HGF的刺激下c-Met才能被激活發(fā)生磷酸化,誘導(dǎo)細(xì)胞的移動(dòng)和遷移。我們的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在無HGF刺激時(shí),A549細(xì)胞基本上不發(fā)生遷移,但在培養(yǎng)細(xì)胞中加入25ng/mL HGF作用48h后,能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生移動(dòng)；在此模型基礎(chǔ)上同時(shí)加入不同濃度的SMU-B后,能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)。此外,細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,在無HGF刺激下,大量A549腫瘤細(xì)胞穿過濾膜,表現(xiàn)出明顯的侵襲特性,SMU-B能顯著抑制HGF誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的穿膜運(yùn)動(dòng),顯示化合物具有抗腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的作用。 六.SMU-B在體外能顯著抑制外源性HGF誘導(dǎo)的A549肺癌細(xì)胞c-Met.AKT及ERK1/2蛋白的磷酸化；也能在體外抑制GTL-16胃癌細(xì)胞和在體內(nèi)抑制GTL-16胃癌裸鼠異體移植瘤的c-Met、AKT和ERK1/2蛋白的磷酸化,通過抑制c-Met信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用 為了探討SMU-B對(duì)c-Met異常腫瘤產(chǎn)生抗腫瘤作用時(shí),是否同時(shí)能抑制c-Met和下游信號(hào)分子的激活,我們以外源性HGF激活的A549肺癌和c-Met擴(kuò)增的GTL-16胃癌細(xì)胞模型,研究了化合物對(duì)c-Met及其下游介導(dǎo)細(xì)胞增殖的信號(hào)分子AKT(蛋白激酶B)和介導(dǎo)細(xì)胞存活的信號(hào)分子ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase)的磷酸化的影響。我們發(fā)現(xiàn),A549細(xì)胞在HGF的作用下,c-Met, AKT和ERK1/2的磷酸化明顯增加；SMU-B能顯著抑制HGF誘導(dǎo)的c-Met、AKT及ERKl/2蛋白的磷酸化。同樣,SMU-B也能在體外抑制GTL-16胃癌細(xì)胞c-Met的磷酸化以及抑制GTL-16裸鼠異體移植瘤c-Met、AKT以及ERK1/2蛋白的磷酸化。上述結(jié)果表明,SMU-B通過抑制裸鼠移植腫瘤的c-Met信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。 結(jié)論 1.本文在設(shè)計(jì)和合成的一系列3-位芐氧基取代的2-氨基吡啶化合物中,首次發(fā)現(xiàn)SMU-B對(duì)c-Met生化和細(xì)胞激酶活性抑制的IC50值分別為1.87nM和22nM,對(duì)ALK激酶生化和細(xì)胞活性抑制的ICso值分別為0.5和39nM,表明該化合物一種高選擇性c-Met/ALK雙重抑制劑。 2. SMU-B在體外對(duì)四種c-Met異常的人腫瘤細(xì)胞生長有顯著的抑制作用。對(duì)c-Met擴(kuò)增的人胃癌GTL-16細(xì)胞生長抑制的IC50值為0.020gM,對(duì)c-Met擴(kuò)增的人肺癌H1993細(xì)胞為1.58μM,對(duì)c-Met高表達(dá)人肺癌H441細(xì)胞為2.02μM,但對(duì)人HGF自分泌的腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞生長抑制的IC5010μM抑制作用較弱。 3.SMU-B對(duì)c-Met擴(kuò)增的人胃癌GTL-16,c-Met高表達(dá)人肺癌H441以及HGF自分泌的腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞三種裸鼠異體移植腫瘤有顯著的抗腫瘤生長作用。化合物在20mg/kg和40mg/kg給藥時(shí),對(duì)U87MG的抑瘤率分別為60.7%和92.3%,對(duì)GTL-16為56.6%和84.8%,而對(duì)H441的抑瘤率為58.8%和78.7%,具有比較強(qiáng)的抗腫瘤作用。 4. SMU-B在體外能抑制外源性HGF誘導(dǎo)的人A549肺癌細(xì)胞的遷移和跨膜移動(dòng),具有抗腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲作用。 5. SMU-B在體外能顯著抑制外源性HGF誘導(dǎo)的A549肺癌細(xì)胞c-Met、AKT及ERKl/2蛋白的磷酸化；也能在體外抑制GTL-16胃癌細(xì)胞和在體內(nèi)抑制GTL-16胃癌裸鼠異體移植瘤的c-Met、AKT和ERK1/2蛋白的磷酸化,通過抑制c-Met信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1767742