本文選題：篩選　切入點：蛋白表達差異性　出處：《東華大學》2017年碩士論文

【摘要】：抗真菌藥物耐藥性已成為亟需解決的全球性難題,耐藥性引起的死亡率較高且難以治療,也是臨床抗真菌藥物治療失敗的主要原因。所以深入研究真菌耐藥機制并能控制和解決其耐藥性的發(fā)生,對國民的身體健康和社會的和諧發(fā)展有著非常重要的意義。臨床真菌對氟胞嘧啶(5-FC)易產(chǎn)生耐藥性,但機制非常復雜,本文試圖開展該藥物耐藥性新機制研究。首先,在對5-FC耐藥菌株的篩選以及之后SDS-PAGE對高耐藥性菌株酵母總蛋白表達特性分析進行初步探索之后,我們發(fā)現(xiàn)抗性菌株相比于野生型菌株蛋白含量明顯發(fā)生改變,但是通過誘變篩選的菌株對5-FC耐受性不具有特異性,特別是所得到的5-FC高耐受性菌株蛋白水平所表現(xiàn)出的差異可能是許多不同的基因共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。為了篩選出對5-FC有特異耐受性的靶向基因,我們用過表達基因庫來篩選特異性抗5-FC的靶向基因,以期尋找5-FC耐受機制新途徑。其次,我們通過釀酒酵母必需基因過表達庫的篩選,發(fā)現(xiàn)過表達Sc GFA1基因后明顯提高了細胞對5-FC的耐受性。已知GFA1基因參與了細胞壁中幾丁質(zhì)的合成,首先用卡爾科弗盧爾熒光增白劑(CFW)染色法和熒光分光光度計檢測了細胞中幾丁質(zhì)的含量,發(fā)現(xiàn)過表達Sc GFA1提高了細胞中幾丁質(zhì)的合成,而5-FC處理后細胞中幾丁質(zhì)含量明顯下降。我們推測過表達Sc GFA1對5-FC耐藥性的原因可能與細胞中幾丁質(zhì)的合成有關。為此,進一步克隆構建了細胞幾丁質(zhì)合成代謝途徑相關的一系列基因CRH1,GNA1,CHS2,PCM1,QRI1和CDA1,發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母野生型菌株中過表達這些基因?qū)?-FC也具有耐受性。值得注意的是幾丁質(zhì)合成酶缺失突變體chs1Δ,chs3Δ對5-FC非常敏感,意味著幾丁質(zhì)的合成與5-FC的耐受性具有密切的相關性。此外我們在幾丁質(zhì)合成代謝的補救途徑中添加葡萄糖胺(Glc-N),發(fā)現(xiàn)其可以使野生型菌株BY4741對5-FC具有耐受性,而Sc GFA1過表達菌株對5-FC的耐受性受到抑制。此外,我們發(fā)現(xiàn)甘露糖蛋白合成代謝也影響幾丁質(zhì)的合成,但其途徑十分復雜至今還不清楚。我們觀察到甘露糖蛋白合成相關的某些基因CWP2,VRG1 and MNT2的缺失也增加了幾丁質(zhì)的合成。而甘露糖蛋白合成相關缺失突變體cwp2Δ,vrg1Δ和mnt2Δ過表達ScGFA1也對5-FC具有耐受性。通過進一步克隆構建甘露糖蛋白合成相關基因CWP2,VRG4和MNT2,發(fā)現(xiàn)上調(diào)甘露糖蛋白的合成也能產(chǎn)生對5-FC的耐受性。最后我們利用高效液相色譜法(HPLC)檢測了細胞中糖核苷酸UDP-GLC的含量,發(fā)現(xiàn)5-FC處理后細胞中UDP-GLC的含量明顯增加,結(jié)合前期我們發(fā)現(xiàn)的5-FC能降低細胞中幾丁質(zhì)的合成,因此實驗結(jié)果表明5-FC可能通過抑制細胞壁中糖核苷酸的分解,進一步導致了細胞壁中幾丁質(zhì)含量的下降,而過表達Sc GFA1可以抵抗和彌補5-FC造成的這種損失。最后在釀酒酵母中異源表達致病酵母白色念珠菌的CaGFA1,發(fā)現(xiàn)其對5-FC的耐受性同樣存在,并且白色念珠菌經(jīng)5-FC處理后,細胞中幾丁質(zhì)含量也明顯下降。因此過表達GFA1賦予5-FC的耐受性在致病酵母白色念珠菌中也同樣具有保守性,說明這是個保守的跨物種的機制。其結(jié)果為今后進一步研究幾丁質(zhì)合成代謝介導的5-FC的耐藥機制奠定了基礎。
[Abstract]:In order to find a new way to improve the resistance of 5 - FC to 5 - FC , we have found that overexpression of Sc GFA1 can improve the tolerance of 5 - FC . The results provide a basis for further research on the drug resistance mechanism of 5 - FC mediated by chitin synthesis .

【學位授予單位】：東華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R978.5

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本文編號：1724801