本文選題：鐘基因　切入點：晝夜節(jié)律　出處：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：氰戊菊酯(fenvalerate,Fen)是一種重要的環(huán)境化學(xué)污染物(ECPs),因其廣譜高效且在環(huán)境中可相對快速降解等優(yōu)點而被廣泛使用。但已有研究顯示氰戊菊酯暴露可導(dǎo)致雄性生殖功能的損害。自然界大多數(shù)生物的生理和行為功能都存在晝夜節(jié)律。正是由于這種節(jié)律的存在,使得機體在晝夜24小時中不同時相對同一藥物或毒物的敏感性不同。動物實驗表明,對相同劑量農(nóng)藥的毒性反應(yīng),有時在其他條件一致的情況下,僅僅由于染毒時間的不同就會造成中毒程度的差別,甚至出現(xiàn)在一個時間高度敏感,而在另一個時間完全不發(fā)生反應(yīng)的“全或無”現(xiàn)象。本研究從生物鐘基因調(diào)節(jié)生物節(jié)律的角度,將時間生物學(xué)與生殖毒理學(xué)方法相結(jié)合,研究農(nóng)藥氰戊菊酯對男(雄)性生殖功能的時間毒性及其機制,為農(nóng)藥暴露致男性生殖功能障礙的診治和預(yù)防提供新的途徑。第一部分氰戊菊酯對雄性大鼠生殖功能的晝夜時間毒性近年來有關(guān)氰戊菊酯暴露對生殖系統(tǒng)的危害越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。研究表明氰戊菊酯可干擾機體的生殖內(nèi)分泌功能,能夠與雌激素受體結(jié)合而產(chǎn)生擬雌激素活性,在報告基因?qū)嶒炛幸脖蛔C實具有擬雌激素和抗雄激素活性。氰戊菊酯暴露能引起精液質(zhì)量下降,影響睪酮合成,對男(雄)性生殖系統(tǒng)可產(chǎn)生損害作用。目的:研究氰戊菊酯對雄性大鼠生殖功能的晝夜時間毒性,為合理使用氰戊菊酯提供理論依據(jù)。方法:在一天中不同的晝夜時間點(CT9:00、CT13:00、CT17:00、CT21:00、CT1:00、CT5:00)對雄性大鼠進行氰戊菊酯染毒,染毒濃度60mg/kg,染毒30天后,在各時間點(CT9:00、CT13:00、CT17:00、CT21:00、CT1:00、CT5:00)對大鼠進行眼眶靜脈取血,檢測血清睪酮(T)、雌激素(E2)、促性腺激素釋放激素(Gn RH)、促黃體生成素(LH)、卵泡生成激素(FSH)的水平,研究氰戊菊酯對雄性大鼠生殖功能的晝夜時間毒性。結(jié)果:氰戊菊酯暴露后,大鼠血清睪酮水平較對照組均顯著下降,而雌激素、促性腺激素釋放激素、促黃體生成素和卵泡生成激素水平升高。對照組大鼠睪酮及雌激素的分泌具有晝夜節(jié)律,睪酮峰值位相分別為:-136.57(CT1:00)、-170.06(CT5:00)、-34.92(CT9:00)、-85.08(CT13:00)、-89.13(CT17:00)和-120.29(CT21:00);雌激素峰值位相分別為:-45.8(CT1:00)、-43.61(CT5:00)、-100.55(CT9:00)、-51.99(CT13:00)、-56.45(CT17:00)和-45.64(CT21:00)。氰戊菊酯染毒后,各時點睪酮水平分別下降了5.7%(CT1:00)、10.4%(CT5:00)、16.7%(CT9:00)、13.1%(CT13:00)、20.6%(CT17:00)、10.4%(CT21:00);各時點雌激素水平分別上升了2.7%(CT1:00)、23.0%(CT5:00)、40.7%(CT9:00)、26.8%(CT13:00)、52.2%(CT17:00)、33.9%(CT21:00)。睪酮和雌激素晝夜節(jié)律發(fā)生了改變,各時點睪酮峰值位相分別為:-127.78(CT1:00)、-155.42(CT5:00)、-191.9(CT9:00)、-183.06(CT13:00)、-170.78(CT17:00)和-147.97(CT21:00);雌激素峰值位相分別為:-45.8(CT1:00)、-43.61(CT5:00)、-100.55(CT9:00)、-51.99(CT13:00)、-56.45(CT17:00)和-45.64(CT21:00)。其中,改變最大的峰值位相出現(xiàn)在CT9時間點,此時點睪酮峰值位相推后10小時27分,雌激素峰值位相提前2小時29分。提示CT9:00是一天中氰戊菊酯暴露的敏感時間點。第二部分氰戊菊酯對雄性生殖功能晝夜時間毒性的機制探討哺乳動物晝夜節(jié)律由生物鐘基因及其蛋白產(chǎn)物組成的轉(zhuǎn)錄-翻譯負反饋環(huán)來調(diào)節(jié)。哺乳動物鐘基因包括Per1/2/3,Cry1/2,Clock,Bmal1等。鐘基因在哺乳動物的生殖系統(tǒng)中相繼被發(fā)現(xiàn)。已有研究證實哺乳動物生物節(jié)律及鐘基因與生殖功能存在關(guān)聯(lián)。Bmal1敲除的雄性小鼠精子畸形率增高,睪酮分泌減少。干擾雄性小鼠睪丸Clock的表達使精子頂體酶活性顯著下降。提示生物鐘基因?qū)π坌陨彻δ芫哂姓{(diào)節(jié)作用。另有研究表明,micro RNAs可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制對其靶蛋白的表達進行調(diào)節(jié),并參與晝夜節(jié)律的調(diào)控。目的:從micro RNAs調(diào)控生物鐘基因的角度,探討氰戊菊酯對雄性生殖功能晝夜時間毒性的分子機制。方法:選取兩個時間點(CT9:00和CT21:00)氰戊菊酯染毒的大鼠,檢測睪丸樣本鐘基因Bmal1和睪酮合成關(guān)鍵酶(St AR、HSD3b1、17β-HSD)的表達水平。采用micro RNA芯片篩選差異表達的micro RNA,熒光定量PCR進行結(jié)果驗證。結(jié)果:氰戊菊酯CT9:00暴露組大鼠睪丸鐘基因Bmal1、睪酮合成關(guān)鍵酶St AR和HSD3b1的表達較對照組均顯著下降,CT21:00暴露組則無顯著差別。CT9:00與CT21:00暴露組相比,大鼠睪丸組織中差異表達的micro RNA數(shù)量更多,差異更加明顯。PCR結(jié)果驗證CT9:00暴露組的mi R494-3p、mi R142-3p和mi R93-5p的表達較對照組顯著升高,而CT21:00組則無明顯差異。研究證實mi R-93通過轉(zhuǎn)錄前調(diào)控參與晝夜節(jié)律的表達,mi R-494-3p和mi R142-3p的靶基因是鐘基因Bmal1。結(jié)果提示氰戊菊酯可能通過影響micro RNA對鐘基因Bmal1表達的調(diào)節(jié),改變睪酮代謝通路上關(guān)鍵酶的水平,從而表現(xiàn)出對睪酮合成的晝夜時間毒性。第三部分氰戊菊酯暴露與Clock基因多態(tài)性對男性不育的影響Clock基因位于染色體4q12的長臂上。CLOCK蛋白與BMAL1蛋白形成雜二聚體,參與多種鐘基因及鐘控基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。有研究表明Clock基因也參與生殖功能的調(diào)節(jié),在Clock基因敲除的小鼠中,由于體內(nèi)激素濃度的改變而導(dǎo)致不育。但是在人類的生殖領(lǐng)域,目前還未見相關(guān)的報道。男性不育作為一個復(fù)雜疾病,是環(huán)境危險因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。氰戊菊酯作為一種新型的II型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,對暴露人群可產(chǎn)生多種健康危害,特別是男性生殖系統(tǒng)的損害。目的:研究氰戊菊酯暴露與Clock基因多態(tài)性對原發(fā)性男性不育的影響。方法:本部分以478例確診的男性不育病例為對象,分析生物鐘基因Clock三個標(biāo)簽SNPs(rs1801260,rs3817444和rs3749474)與精液質(zhì)量的關(guān)系。以194例正常生育男性為對照,比較SNPs對血清睪酮等激素水平的影響。選取氰戊菊酯的代謝產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸(3-Phenoxybenzoic acid,3-PBA)為內(nèi)暴露標(biāo)志物,應(yīng)用GMDR模型,探討氰戊菊酯暴露與生物鐘Clock基因遺傳多態(tài)性交互作用對原發(fā)性男性不育易感性的影響。結(jié)果:男性不育病例中,Clock基因SNP位點rs3749474與一次射精精子總數(shù)、精液體積與精子活力均存在顯著相關(guān),位點rs1801260和rs3817444分別與精子活動力和精液體積顯著相關(guān)。風(fēng)險分析結(jié)果顯示,Clock基因的多態(tài)性位點可以影響原發(fā)性男性不育的發(fā)病風(fēng)險。病例組人群尿液中3-PBA濃度為1.41 ng/ml,顯著高于對照組人群的0.75 ng/ml。應(yīng)用GMDR3階交互作用模型,發(fā)現(xiàn)原發(fā)性男性不育病例中Clock基因SNP位點(rs3817444、rs1801260)與氰戊菊酯暴露之間存在交互作用,可以作為氰戊菊酯暴露人群發(fā)生生殖功能障礙的危險因素。結(jié)論:氰戊菊酯對雄性大鼠的生殖功能具有晝夜時間毒性,以CT9:00暴露組對大鼠生殖功能的損傷最為明顯。氰戊菊酯對大鼠生殖時間毒性的產(chǎn)生,可能與影響micro RNA—Bmal1—睪酮代謝關(guān)鍵酶—睪酮合成通路的晝夜節(jié)律有關(guān)。氰戊菊酯暴露人群中,Clock基因遺傳多態(tài)性可增加男性不育風(fēng)險,并與原發(fā)性男性不育之間存在交互作用,是氰戊菊酯暴露人群發(fā)生生殖功能障礙的一個危險因素。
[Abstract]:Fenvalerate (fenvalerate, Fen) is an important environmental chemical pollutants (ECPs), because of its broad-spectrum and relatively rapid degradation in the environment has been widely used. But studies have shown that fenvalerate exposure can lead to male reproductive dysfunction. Physiological and behavioral functions are the most biological nature there is a diurnal rhythm. It is because of this rhythm, the body in 24 hours a day not at the same time, the relative sensitivity of the same drug or poison. The animal experiment showed that the toxicity of the same dose of pesticide, sometimes in the same conditions, just because of the different exposure time will cause different degrees of poisoning even highly sensitive, at a time, all or none "phenomenon in another time no reaction." this study regulation of biological rhythm from the angle of the biological clock gene, The combination of time biology and reproductive toxicology research method of fenvalerate on the male (male) time toxicity and mechanism of reproductive function, provide a new way of treatment and prevention of male reproductive dysfunction caused by pesticide exposure. The first part of the day and night time of fenvalerate on the reproductive function of male rats in recent years on cyanide toxicity fenvalerate exposure hazard on reproductive system has attracted more and more attention of scholars at home and abroad. The research showed that fenvalerate can interfere with the body's endocrine function, binds to estrogen receptors and have estrogenic activity, in the reporter gene assay was also confirmed with estrogen and anti androgen activity. Fenvalerate exposure can cause decline in semen quality, affects the synthesis of testosterone, the male (male) of the reproductive system can produce damage. Objective: To study the effect of fenvalerate on the reproductive function of male rats of the day Night time toxicity, and provide a theoretical basis for the rational use of fenvalerate. Methods: day and night at different time in a day (CT9:00, CT13:00, CT17:00, CT21:00, CT1:00, CT5:00) of fenvalerate exposure on male rats exposed to concentrations of 60mg/kg, after 30 days of exposure at each time point (CT9:00, CT13:00 CT17:00, CT21:00, CT1:00, CT5:00), the rat orbital venous blood, serum testosterone test (T), estrogen (E2), gonadotropin-releasing hormone (Gn RH), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH) levels of fenvalerate on reproductive day and night time the function of male rats. Results: the toxicity of fenvalerate exposure, serum testosterone levels in rats were significantly decreased compared with the control group and estrogen, gonadotropin-releasing hormone, luteinizing hormone and follicle stimulating hormone levels. Control group rats increased secretion of testosterone and estrogen with circadian rhythm ,鐫鵑叜宄板，

本文編號：1716602