發(fā)布時(shí)間：2018-04-03 18:52

  本文選題：誘導(dǎo)表位　切入點(diǎn)：印跡　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：近年來(lái),選擇合適的配體如多肽、抗體、核酸適配體等修飾于遞藥系統(tǒng),用于特異性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞膜表面特定的受體并與之結(jié)合,是實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向的重要策略之一。分子印跡技術(shù)是以制備分子印跡聚合物為目標(biāo),選擇合適的模板分子,人工合成具有特異性分子識(shí)別功能物質(zhì)的一種技術(shù)。分子印跡聚合物與其模板重結(jié)合的過(guò)程類似于拿“鑰匙”開(kāi)“鎖”的過(guò)程,與天然抗體相比,分子印跡聚合物作為“人工抗體”具有制備可控性強(qiáng)、理化性質(zhì)穩(wěn)定、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),并且具有一定三維空間結(jié)構(gòu)的模板印跡聚合物與模板分子進(jìn)行特異性結(jié)合的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于一級(jí)結(jié)構(gòu)的模板印跡聚合物。本課題組前期將分子印跡技術(shù)與多肽設(shè)計(jì)相結(jié)合,提出以具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽作為模板分子的構(gòu)象表位印跡策略,并將其用于腫瘤靶向藥物遞送。其選取p32蛋白末端關(guān)鍵氨基酸序列嫁接于蜂毒明肽apamin,設(shè)計(jì)合成α螺旋構(gòu)型的多肽并將其作為模板分子制備印跡納米粒,用于p32蛋白高表達(dá)的腫瘤靶向藥物遞送。然而,p32蛋白末端為特殊的α螺旋結(jié)構(gòu),生物體內(nèi)大部分膜蛋白的末端沒(méi)有特定的二級(jí)結(jié)構(gòu),使得這一策略有了局限性。那么對(duì)于大部分末端無(wú)固定二級(jí)結(jié)構(gòu)的膜蛋白,我們可否將其末端誘導(dǎo)為一定的二級(jí)結(jié)構(gòu),以期其與印跡納米粒發(fā)生較強(qiáng)的特異性結(jié)合呢?基于此,本論文特提出誘導(dǎo)表位印跡策略,即選擇合適的誘導(dǎo)劑將線性肽誘導(dǎo)為α螺旋結(jié)構(gòu),并以“α螺旋化”的多肽作為模板合成分子印跡納米粒,該納米�？蓪⑵湎鄳�(yīng)的膜蛋白末端誘導(dǎo)趨向于α螺旋,并發(fā)生較強(qiáng)的特異性結(jié)合作用。以葉酸受體(Folate receptor,FR)為模型,多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體,常將其作為靶點(diǎn)用于腫瘤靶向藥物遞送,而葉酸受體蛋白N端多肽鏈(FN)為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu),選擇合適的誘導(dǎo)劑將FN肽誘導(dǎo)為α螺旋,以“α螺旋化”的FN肽為模板分子,合成分子印跡納米粒(MIPNP-F),特異性的識(shí)別并誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面FR末端多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)趨向于α螺旋,并進(jìn)行特異性結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向。更值得關(guān)注的是,葉酸(Folic acid,FA)與FR的結(jié)合口袋遠(yuǎn)離FR末端,可有效避免游離葉酸對(duì)MIPNP-F的靶向效果產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。本論文第一部分對(duì)誘導(dǎo)表位印跡策略進(jìn)行可行性分析。分別以apamin(α螺旋結(jié)構(gòu))及其線性衍生物linear apamin(apamin的4個(gè)半胱氨酸替換為丙氨酸)為模板分子,采用沉淀聚合法制備具有α螺旋“孔穴”的分子印跡納米粒(MIPNP-A)和具有無(wú)規(guī)則線性“孔穴”的分子印跡納米粒(MIPNP-L),探究MIPNP-A和MIPNP-L與apamin及l(fā)inear apamin間的相互作用發(fā)現(xiàn),MIPNP-A可將linear apamin誘導(dǎo)為α螺旋,并發(fā)生較強(qiáng)的特異性結(jié)合,而MIPNP-L對(duì)apamin的結(jié)合作用則較弱。該結(jié)果提示,具有α螺旋結(jié)構(gòu)“孔穴”的印跡納米�？蓪⑵渚�性模板肽誘導(dǎo)為α螺旋并發(fā)生較強(qiáng)的特異性結(jié)合作用,反之,有線性“孔穴”的印跡納米粒對(duì)α螺旋的模板肽作用則較弱,初步表明在構(gòu)象表位印跡基礎(chǔ)上提出的誘導(dǎo)表位印跡策略具備一定可行性。為進(jìn)一步探索將誘導(dǎo)表位印跡策略用于腫瘤靶向藥物遞送,以FR高表達(dá)的腫瘤靶向?yàn)榇?選擇FR末端一段關(guān)鍵序列,設(shè)計(jì)合成FN肽,測(cè)定其二級(jí)結(jié)構(gòu),證明其本身為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu),50%的三氟乙醇(2,2,2-Trifluoroethanol,TFE)可將其誘導(dǎo)為α螺旋。以丙烯酰胺和2-(三氟甲基)-丙烯酸為功能單體,以N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺和丙烯酸三氟乙酯為交聯(lián)劑,以FN肽為模板分子,在50%TFE溶劑中合成具有α螺旋“孔穴”的分子印跡納米粒(MIPNP-F),用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定其粒徑為(78.3±2.5)nm,多分散系數(shù)為(0.175±0.023),通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡觀察顯示納米粒為分布均勻,外觀圓整的球形結(jié)構(gòu),提示MIPNP-F制備成功,為以MIPNP-F為載體用于葉酸受體高表達(dá)的腫瘤靶向藥物遞送奠定了基礎(chǔ)。第二部分主要對(duì)MIPNP-F進(jìn)行體內(nèi)外功能評(píng)價(jià)和作為遞藥載體的安全性考察。多肽結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)和體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示,MIPNP-F可將其線性模板肽的α螺旋比例由5%誘導(dǎo)為36%,并發(fā)生特異性結(jié)合。納米粒-細(xì)胞相互作用實(shí)時(shí)分析結(jié)果顯示,MIPMP-F與He La細(xì)胞作用有更高的信號(hào)響應(yīng)值,KD值(2.81E-8±5.81E-10)也顯著低于非印跡納米粒(Non-imprinted polymer nanoparticles,NIPNP)與HeLa細(xì)胞作用的KD值(2.15E-5±3.05E-7)。用熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀測(cè)定MIPNP-F的細(xì)胞攝取情況發(fā)現(xiàn),在FR高表達(dá)的HeLa、KB和PANC-1細(xì)胞上,MIPNP-F的細(xì)胞攝取量分別為NIPNP的3.89倍、4.05倍和3.46倍,而在FR低表達(dá)的A549和MCF7細(xì)胞上,MIPNP-F和NIPNP的細(xì)胞攝取量沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差別。探索MIPNP-F胞吞機(jī)制發(fā)現(xiàn),其入胞途徑與葉酸修飾的納米粒(FA-NP)基本一致,主要通過(guò)穴樣凹陷內(nèi)吞和大胞飲途徑內(nèi)吞,初步表明MIPNP-F可經(jīng)葉酸受體介導(dǎo)入胞。小動(dòng)物活體成像檢測(cè)納米粒的體內(nèi)分布表明,MIPNP-F的腫瘤積累量明顯高于NIPNP。將光敏劑亞甲基藍(lán)包載于納米粒中,用光動(dòng)力療法進(jìn)行細(xì)胞藥效學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),在觀察期內(nèi)MIPNP-F組的IC50為2.12μg·mL-1,明顯低于NIPNP組IC50值3.96μg·mL-1;進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)考察發(fā)現(xiàn),MIPNP-F給藥組裸鼠皮下瘤大小基本維持不變,而NIPNP組腫瘤則呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。更值得關(guān)注的是,在細(xì)胞與游離葉酸孵育以及在裸鼠腫瘤附近給予高濃度葉酸預(yù)處理前提下,與FA-NP相反,葉酸對(duì)MIPNP-F的體內(nèi)外靶向效果沒(méi)有產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。對(duì)印跡納米遞藥載體進(jìn)行體內(nèi)外安全性評(píng)價(jià),結(jié)果初步顯示,治療劑量的空白印跡聚合物納米粒對(duì)細(xì)胞和裸鼠機(jī)體沒(méi)有明顯毒性作用。以上細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出MIPNP-F體內(nèi)外良好的靶向性,出色的藥效學(xué)性質(zhì)及生物安全性,展現(xiàn)出將其作為遞藥載體用于腫瘤靶向光動(dòng)力治療的巨大潛力。綜上所述,本文在構(gòu)象表位印跡的基礎(chǔ)上,提出誘導(dǎo)表位印跡策略,并將其作為載體用于腫瘤靶向藥物遞送。在一定程度上解決了大部分膜蛋白質(zhì)域結(jié)構(gòu)靈活多變,難以靶向的問(wèn)題;拓寬了受體識(shí)別的概念,為分子印跡技術(shù)的應(yīng)用及腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供了新的借鑒。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：1706480