本文選題：普拉克索　切入點(diǎn)：有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,存在于人體組織細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子結(jié)構(gòu)和功能逐漸為人們所認(rèn)識(shí),它們?cè)跔I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及藥物的吸收或外排過(guò)程中起著十分重要的作用,并且具有高度的選擇性和特異性。有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(Organic cation transporters, OCTs)表達(dá)于腎臟、肝臟和小腸,可以介導(dǎo)許多內(nèi)源性胺類和藥物的吸收與消除。OCT的底物分布廣泛,臨床應(yīng)用的藥物大約有50%是有機(jī)陽(yáng)離子藥物,包括抗心律失常藥、抗帕金森藥、抗組胺藥、β-腎上腺素受體拮抗藥等。普拉克索(pramipexole, PPX)在生理?xiàng)l件下是以有機(jī)陽(yáng)離子的形式存在的,但OCT介導(dǎo)的PPX體內(nèi)過(guò)程研究尚不清楚。因此,本課題擬研究OCT在PPX黏膜吸收和腎臟排泄中的作用,并探討OCT介導(dǎo)的PPX與西咪替丁發(fā)生藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)。 本文首先建立了PPX在不同生物基質(zhì)中的LC-MS/MS定量分析方法。選用d3-PPX作為內(nèi)標(biāo),分別采用蛋白沉淀結(jié)合弱陽(yáng)離子交換固相萃取(Solid phase extraction, SPE)和乙酸乙酯液液萃取的方法處理組織樣品和其它生物基質(zhì),并通過(guò)柱后推注法、預(yù)處理后加樣法、源內(nèi)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(In-source multiple reaction monitoring, IS-MRM)直接評(píng)價(jià)甘油磷酸膽堿(Glycerophosphocholines, GPChos)和溶血甘油磷酸膽堿(Lyso-glycerophosphocholines, Lyso-GPChos)的方法系統(tǒng)評(píng)價(jià)了基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生和消除機(jī)制,成功解決了組織樣品中內(nèi)源性成分對(duì)分析測(cè)定的干擾。采用Ultimate(?) XB-CN柱進(jìn)行色譜分離,分析時(shí)長(zhǎng)僅為3.0min,保證了高通量的樣品分析。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明PPX的血漿和組織樣品在0.05-100ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r0.99,低、中、高三個(gè)QC濃度測(cè)定的日內(nèi)、日間精密度(RSD)均小于10.6%,血漿和腦組織的準(zhǔn)確度分別為95.2%～105.6%和91.4%～108.2%,提取回收率在80.7%～90.3%的范圍內(nèi),基質(zhì)效應(yīng)偏差為-13.8%～-1.2%,不同條件下穩(wěn)定性的偏差在±15%的范圍內(nèi),各項(xiàng)指標(biāo)均符合生物樣品分析方法驗(yàn)證的相關(guān)要求。表明該方法準(zhǔn)確、靈敏,可以滿足體內(nèi)、體外相關(guān)試驗(yàn)的需求。 為考察OCT在PPX腸道吸收中可能發(fā)揮的作用,本課題利用擴(kuò)散池模型研究了PPX在大鼠十二指腸、空腸及回腸的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)情況,并通過(guò)不同種類的抑制劑試驗(yàn)初步推測(cè)PPX可能的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。結(jié)果顯示在1-50μM的濃度范圍內(nèi),PPX從AP-BL側(cè)(黏膜側(cè)-漿膜側(cè))和BL-AP側(cè)(漿膜側(cè)-黏膜側(cè))跨大鼠不同腸段的累計(jì)通透量均呈線性,且分泌方向要高于吸收方向。在回腸中,加入有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑(金剛烷胺、胍、普魯卡因胺、四乙胺、奎寧和維拉帕米)后,PPX的累計(jì)通透量明顯降低。但是,在十二指腸和空腸的試驗(yàn)中,只有部分抑制劑有抑制效果,表明OCT可能介導(dǎo)了PPX在大鼠腸道的外排轉(zhuǎn)運(yùn),且其在小腸的表達(dá)存在區(qū)域性差異。此外,其他轉(zhuǎn)運(yùn)體(如P-gp)也可能參與PPX的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。總之,上述結(jié)果提示有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)PPX腸道吸收的貢獻(xiàn)較小,提示OCT介導(dǎo)的PPX口服吸收過(guò)程中產(chǎn)生臨床DDI的風(fēng)險(xiǎn)較低。 由于帕金森疾病(Parkinson's disease, PD)的病變部位位于顱內(nèi),PPX口服給藥后藥物需要透過(guò)腸黏膜吸收進(jìn)入體循環(huán)后進(jìn)而跨過(guò)血腦屏障(Blood brain barrier, BBB)才能實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)遞藥,這將會(huì)使藥物向腦內(nèi)的遞送速率和遞送量大大下降,極大地限制了PPX對(duì)PD的治療�；谏鲜隹紤],我們嘗試通過(guò)改變給藥方式來(lái)增加PPX向腦內(nèi)的遞送。鼻腔和腦在生理學(xué)上存在獨(dú)特的聯(lián)系,且鼻腔給藥后藥物可以直接通過(guò)“鼻-腦,,通路繞過(guò)BBB進(jìn)入腦內(nèi),從而增加藥物的腦內(nèi)遞藥。因此,接下來(lái)考察了PPX鼻黏膜給藥后實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)“靶向”遞藥的可能性。通過(guò)小鼠腦組織勻漿法和切片法研究PPX靜脈給藥、口服給藥和鼻腔給藥后在血漿和腦組織中的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程,并采用ADAPT5軟件對(duì)主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行了擬合。模型擬合結(jié)果顯示靜脈給藥和口服給藥后PPX在體內(nèi)呈一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程,鼻腔給藥后藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)為飽和吸收過(guò)程,但被動(dòng)擴(kuò)散也可能是轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制之一,且約有20%的藥物是通過(guò)“鼻-腦”通路直接轉(zhuǎn)運(yùn)入腦的。與口服給藥相比,鼻腔給藥后腦內(nèi)PPX的達(dá)峰時(shí)間從1h提前至30min,Cmax由14.65±0.43ng/g增加至20.37±6.30ng/g,腦靶向效率為口服給藥組的1.3倍,證明鼻腔給藥可以更快地實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)遞藥,提高腦內(nèi)藥物濃度。小鼠冠狀腦切片模型結(jié)果顯示鼻腔給藥后2min-20min每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn),腦內(nèi)藥物濃度的變化趨勢(shì)呈先下降后上升的趨勢(shì)(從“頭,,到“尾”),符合鼻腔給藥的特點(diǎn)。上述結(jié)果提示對(duì)PPX而言,鼻腔給藥比口服給藥更有優(yōu)勢(shì),而且鼻腦直接轉(zhuǎn)運(yùn)通路對(duì)PPX轉(zhuǎn)運(yùn)入腦發(fā)揮了重要作用。 在PPX鼻腔給藥的藥動(dòng)學(xué)研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了PPX跨鼻黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制。采用牛鼻黏膜離體組織模型和相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)考察了OCT在PPX跨牛鼻黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。結(jié)果顯示PPX在牛嗅黏膜M-S方向(黏膜側(cè)-黏膜下側(cè))的轉(zhuǎn)運(yùn)呈飽和趨勢(shì),且高于S-M(黏膜下側(cè)-黏膜側(cè))方向,米氏方程擬合后,最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率Jmax為18.62±5.46ng cm-2min-1,Km值為44.66±22.65μM。而在呼吸黏膜中兩個(gè)方向的轉(zhuǎn)運(yùn)速率基本一致。加入不同種類的有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑后,PPX在嗅黏膜中的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取過(guò)程均被抑制,而在呼吸黏膜中,只有攝取被抑制,轉(zhuǎn)運(yùn)速率無(wú)顯著變化。提示OCTs尤其是OCT1和OCT2可能主要介導(dǎo)了PPX跨嗅黏膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,但在其跨呼吸黏膜的吸收過(guò)程中貢獻(xiàn)較小。孵育介質(zhì)不同離子組成對(duì)PPX跨牛嗅黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程依賴于跨膜電勢(shì),但不依賴于pH梯度和鈉離子,進(jìn)一步從轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制層面證明了OCT介導(dǎo)了PPX跨鼻黏膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外,通過(guò)Western Blot技術(shù)和免疫組化技術(shù)考察了OCT1和OCT2在牛鼻黏膜中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示OCT1和OCT2不僅表達(dá)在牛鼻黏膜的頂膜側(cè)(黏膜側(cè)),還分布在黏膜下的廣大區(qū)域,如血管、腺體、淋巴管等,提示這可能與腎臟中OCT1和OCT2的作用相似,主要協(xié)助PPX進(jìn)入或離開(kāi)這些區(qū)域。 對(duì)于PPX這個(gè)有機(jī)陽(yáng)離子化合物而言,OCT在其腸道吸收過(guò)程中存在一定的作用,而在牛鼻黏膜的轉(zhuǎn)運(yùn)中也發(fā)揮著重要作用,這提示我們可以充分利用OCT這個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)或遞送。此外,OCT在腎臟也高度表達(dá),PPX吸收后在體內(nèi)的處置過(guò)程是否也跟OCT有關(guān)是一個(gè)非常值得我們關(guān)注的問(wèn)題。因此,研究了腎臟OCT介導(dǎo)的PPX排泄機(jī)制,選擇臨床常用藥物西咪替丁(OCT的底物和競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑)為合并用藥藥物,采用整體動(dòng)物模型、離體腎切片模型及轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型考察西咪替丁對(duì)PPX腎臟排泄的影響,并探討兩者發(fā)生藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)和機(jī)制。整體動(dòng)物的藥動(dòng)學(xué)研究表明當(dāng)西咪替丁與PPX同時(shí)給藥后,與對(duì)照組相比PPX的血漿AUC(o-12h)增加了2.45倍,平均血漿清除率下降了2.30倍,而PPX在24h內(nèi)的累積尿藥排泄量顯著下降,腎臟清除率下降了3倍。表明西咪替丁抑制了PPX的腎臟排泄和在血漿中的清除,提示在腎臟排泄過(guò)程中,PPX和西咪替丁是由相同的轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)介導(dǎo)的,臨床合用西咪替丁可能降低PPX的腎排泄作用。腎切片試驗(yàn)表明OCT抑制劑胍(1mM)、西咪替丁(0.5mM和1mM)以及0.1mM-1mM濃度范圍的TEA均對(duì)PPX的腎臟攝取有顯著抑制作用,且具有濃度依賴性,提示這種相同的轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)與OCT相關(guān)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步從分子水平證明了西咪替丁是通過(guò)抑制OCT2而影響PPX腎臟排泄的,且西咪替丁的Cumax/IC50=0.87,大于國(guó)際轉(zhuǎn)運(yùn)體協(xié)會(huì)(International Transporter Consootium,ITC)推薦的0.1的標(biāo)準(zhǔn),提示PPX與西咪替丁在臨床上很有可能發(fā)生藥物相互作用,且該作用主要是由腎臟OCT2介導(dǎo)的。
[Abstract]:In recent years , with the development and application of molecular biology technology , the molecular structure and function of transport proteins present in human tissue cells are gradually recognized . They play a very important role in the absorption or efflux of nutrients and drugs .

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本文編號(hào)：1674439