本文選題：三羥基雄甾烯酮　切入點(diǎn)：Colletotrichum　出處：《江南大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：三羥基雄甾烯酮(7α,15α-diOH-DHEA)是合成第四代口服避孕藥Yasmin有效成分屈螺酮的關(guān)鍵中間體,Yasmin作為全球銷量第一的避孕藥使得7α,15α-diOH-DHEA的生產(chǎn)成為藥物合成領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選到一株亞麻刺盤孢(Colletotrichum lini)ST能雙羥化去氫表雄酮(DHEA)生成7α,15α-diOH-DHEA。然而在其轉(zhuǎn)化過程中,存在底物投料濃度低、菌株羥化能力弱及轉(zhuǎn)化效率差等問題,很大程度制約了菌株C.lini ST在工業(yè)化生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用。因此,本論文以C.lini ST為出發(fā)菌株,采用基因組改組(genome shuffling)育種技術(shù),篩選獲得能高效轉(zhuǎn)化DHEA合成7α,15α-di OH-DHEA的菌株,并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株羥化能力增強(qiáng)的原因進(jìn)行初步探索。在此基礎(chǔ)上,首次獲得一個(gè)來源于絲狀真菌C.lini中起著羥化DHEA作用的P450氧化酶并成功表達(dá)。具體結(jié)論總結(jié)如下:(1)選育了能高效轉(zhuǎn)化DHEA制備7α,15α-diOH-DHEA的優(yōu)勢(shì)融合菌株。以C.lini ST為出發(fā)菌株,首先將高濃度乙醇作為篩選壓力,利用等離子誘變(ARTP)技術(shù)選育了一株高產(chǎn)菌株C.lini ST-y9。進(jìn)而將其與另一株實(shí)驗(yàn)室保藏的以高濃度DHEA為篩選壓力誘變獲得的高產(chǎn)菌株C.lini ST-0317作為genome shuffling育種的雙親本。經(jīng)過三輪的genome shuffling,最終獲得三株能高效雙羥化DHEA生成7α,15α-diOH-DHEA的優(yōu)勢(shì)融合菌株。(2)簡(jiǎn)要評(píng)價(jià)了融合菌株的性能并初步探索了其羥化能力提高的原因。通過對(duì)優(yōu)勢(shì)融合菌株的5次傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)C.lini ST-F307具有良好的遺傳穩(wěn)定性,該菌株在底物DHEA投料濃度為10 g·L-1時(shí),目的產(chǎn)物7α,15α-diOH-DHEA的摩爾得率達(dá)到54.8%,較出發(fā)菌株C.lini ST(28.1%)提高了26.7%。隨后優(yōu)化了C.lini ST-F307的轉(zhuǎn)化條件,當(dāng)添加1.5%(v/v)的乙醇助溶時(shí),能將底物DHEA的投料濃度提高至12 g·L-1,同時(shí)產(chǎn)物7α,15α-diOH-DHEA的摩爾得率提高至69.9%。由于甾體的羥化過程主要由P450酶系完成,因此分別測(cè)定了不同C.lini菌株(出發(fā)菌株C.lini ST、親本菌株C.lini ST-0317、C.lini ST-y9和融合菌株C.lini ST-F307)粗酶液的P450酶活,結(jié)果表明C.lini ST-F307的P450酶活最高(45.2 U·mg-1)。進(jìn)一步對(duì)各菌株中部分P450酶基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析比較,發(fā)現(xiàn)相比于出發(fā)菌株和親本菌株,融合菌株C.lini ST-F307的5個(gè)P450酶基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯提高。由此可知P450酶的基因轉(zhuǎn)錄水平以及活性的提高導(dǎo)致了融合菌株C.lini ST-F307雙羥化DHEA能力的增強(qiáng)。(3)擴(kuò)增獲得了C.lini ST-F307中起羥化DHEA作用的P450氧化酶,并對(duì)其進(jìn)行了功能驗(yàn)證。由上述分析結(jié)果得知,C.lini ST-F307菌株中位于微粒體的一個(gè)P450氧化酶CYP3的基因轉(zhuǎn)錄水平最高,因此推測(cè)該P(yáng)450氧化酶為羥化DHEA的一個(gè)關(guān)鍵酶。隨后擴(kuò)增出其完整的基因片段,經(jīng)分析該蛋白屬于CYP68J亞家族,命名為CYP68JX。進(jìn)一步成功地將CYP68JX在畢赤酵母GS115體系中進(jìn)行了外源表達(dá),并利用重組酵母菌株進(jìn)行了DHEA轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:當(dāng)?shù)孜顳HEA的投料濃度為2 g·L-1時(shí),重組表達(dá)菌株GS115-pPIC3.5K-cyp68jx的7α,15α-diOH-DHEA摩爾得率達(dá)到31.8%,是GS115-pPIC3.5K(11.3%)的2.8倍,從而證明P450氧化酶CYP68JX具有雙羥化DHEA的功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R915

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 姚韌輝;;甾體類藥物的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J];科技風(fēng);2016年18期

2 張?jiān)?趙巖;蔡恩博;郜玉鋼;何忠梅;楊鶴;劉雙利;張連學(xué);;膽甾醇的結(jié)構(gòu)修飾與生物活性研究進(jìn)展[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2016年02期

3 馮亞斌;莊欣晨;沈曉霞;江建銘;王忠華;;藥用植物甾體生物堿的藥理作用及合成途徑[J];中國生物工程雜志;2016年01期

4 李恒;吳燕;魏利莎;李會(huì);張曉梅;史勁松;許正宏;;原生質(zhì)體誘變提高亞麻刺盤孢ST對(duì)底物DHEA的耐受性和轉(zhuǎn)化率[J];化工進(jìn)展;2014年09期

5 劉奪;張瑩;周曉;元英進(jìn);;合成生物技術(shù)生產(chǎn)甾體激素中間體的研究展望[J];生命科學(xué);2013年10期

6 趙美榮;;表面活性劑在增加藥物溶解性方面的應(yīng)用及發(fā)展趨勢(shì)[J];企業(yè)科技與發(fā)展;2013年14期

7 許正宏;吳燕;李會(huì);李恒;史勁松;;甾體生物轉(zhuǎn)化技術(shù)研究的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J];生物加工過程;2013年02期

8 楊順楷;楊亞力;吳中柳;范林萍;李小剛;;微生物發(fā)酵降解植物甾醇側(cè)鏈生產(chǎn)17-酮甾體研究進(jìn)展[J];生物加工過程;2010年05期

9 韓廣甸;劉宏斌;;新型女用口服避孕藥屈螺酮的合成進(jìn)展[J];中國藥物化學(xué)雜志;2010年02期

10 劉榮仕;穆曉清;徐巖;聶堯;;樹脂原位吸附促進(jìn)高濃度底物不對(duì)稱氧化還原合成(S)-苯基乙二醇[J];化工進(jìn)展;2008年09期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 葉麗;周s，

本文編號(hào)：1649625