本文選題：基于　切入點：CDK2　出處：《浙江大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：細胞周期調(diào)節(jié)蛋白激酶2(CDK2)屬于高度保守的ser/thr蛋白激酶家族,該類激酶在細胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用,例如,中心體復制、DNA合成、G1期到S期的過渡和G2期的調(diào)控。在哺乳動物細胞中,CDK2主要分布在細胞質(zhì)、中心小體、細胞核、高爾基體、細胞質(zhì)膜以及核內(nèi)體,它與細胞周期蛋白E/A形成異二聚體,調(diào)節(jié)細胞分裂。人源的CDK2結(jié)構為經(jīng)典的激酶雙葉折疊型,包括一段N端(Metl-Val79),二級結(jié)構為β折疊的結(jié)構域,另一段為C端(Asp86-Leu297),二級結(jié)構為α螺旋的結(jié)構域。除此之外,還包括一段鉸鏈區(qū)(Phe80-Gln85),連接著N端和C端�；钚詤^(qū)域(Asp145-Glu172)位于D142FG和A173PE之間,存在底物結(jié)合位點。與其它CDK酶一致,解聚的CDK2是沒有活性的。CDK2和細胞周期蛋白E,不僅調(diào)控細胞分裂G1→S,而且調(diào)節(jié)中心體的復制。在細胞分裂S期的開始階段,激活的CDK2和細胞周期蛋白A復合物,促進多種內(nèi)生底物的磷酸化,從而促進DNA的復制,同時,抑制G1期轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性。大量實驗表明,CDK2的不正常表達,可以造成細胞周期錯誤調(diào)控,這種現(xiàn)象在很多惡性腫瘤中都有發(fā)現(xiàn),例如,肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌和組織肉瘤。因此,CDK2被認作一個治療腫瘤的潛在藥用靶點進行研究�？蒲腥藛T合成了大量的CDK2抑制劑,并且研究了該類化合物治療腫瘤的可行性。目前,科研人員主要采用的三種策略設計CDK2抑制劑,其中,應用做多的是設計針對CDK2的ATP結(jié)合口袋的小分子化合物。CDK2的ATP結(jié)合口袋位于N末端和C末端之間的裂縫中,由21個氨基酸組成。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn),氨基酸Ile10, Val18、Ala31、Lys33、Phe80、 Glu81、Phe8、Leu83、His84、Gln85、Asp86、 Lys89、Gln131、Leu134、Ala144和Asp145,在結(jié)合ATP的過程中發(fā)揮著至關重要的作用。由于此ATP結(jié)合口袋在CDK蛋白家族中的高度保守,使得針對ATP結(jié)合口袋開發(fā)選擇性CDK2抑制劑變得困難重重。因此,科研工作者將目光轉(zhuǎn)向了發(fā)展非ATP結(jié)合的CDK2抑制劑。最近,研究人員發(fā)現(xiàn)了一個新的結(jié)合口袋,由氨基酸Leu55、Lys56、Phe80、Asp145、Phe146和Lys33組成,位于ATP結(jié)合位點和C端α螺旋的中間。另外,新的結(jié)合口袋也被發(fā)現(xiàn),由Leul24、Phe152、 Val154-Val156、Glul72、Gly176-Thr182、Val184、Val227-Val230, Ser232-Pro234和Asp270-Asn272組成,被5肽LAALS和TAALS占據(jù)。然而,到目前為止,針對該非催化性的結(jié)合位點的抑制劑還未有報道,由于非催化性和催化性位點之間的區(qū)別,也為設計合成選擇性的CDK2抑制劑提供了機會。除此之外,研究人員還致力于研究內(nèi)源性的多肽,例如腫瘤壞死因子的產(chǎn)物pl6INK4、p21WAF1、 p27KIP1和P107。這類抑制劑通過阻斷細胞周期,從而有效的抑制細胞增殖。例如,P27KIP1不僅能夠與蛋白較淺的凹陷部分結(jié)合,而且也能與較深的裂隙部分結(jié)合,使得CDK2構象發(fā)生較大改變,最終活性消失。因此,多肽也是一種值得深入研究的針對CDK2的抑制劑。目前,報道最多的針對CDK2仍然為ATP競爭性抑制劑,設計合成了七類不同化學結(jié)構的針對CDK2 ATP結(jié)合位點的化合物,他們具有相似的性質(zhì),例如親水性、較低的分子量和平面性的結(jié)構。其中部分化合物,R-roscovitine、SNS-032. MK7965、BAY 1000394、PHA-793887、AT 7519、ZK 304709和R-547進入了臨床研究,但是由于副作用和較低的靶點特異性,在二期臨床試驗時終止。因此,發(fā)展選擇性的CDK2抑制劑,就變得非常有意義。另一方面,由于ATP結(jié)合位點在CDK蛋白家族中的高度保守,發(fā)展選擇性的CDK2抑制劑的確很具有挑戰(zhàn)性。盡管CDK2的蛋白結(jié)晶的解析,為我們研究CDK2抑制劑提供了依據(jù),但是對于CDK2的選擇性機制還遠遠不夠。因此,利用計算機模擬,闡明CDK2和配體的選擇性機制,對于研制CDK2選擇性抑制劑具有根本意義。CDK4在CDK家族中分布最為廣泛。CDK2和CDK4的折疊形式的相似度達到了45%,其中,在ATP結(jié)合位點,僅僅有4個氨基酸殘基的差別。在CDK2中的Phe82、Leu83、Lys89和Gln131,分別對應CDK4中的His95、Val96、Thr102和Glu144。由于CDK2和CDK4的高度相似,因此,報道過的CDK4和CDK2抑制劑也有一定的相似性。研究發(fā)現(xiàn),敲除掉CDK2和CDK4基因,使得胚胎由于心力衰竭而死亡。此外,據(jù)報道,CDK4在某些內(nèi)分泌細胞的增值過程中發(fā)揮至關重要的作用。當抑制了CDK4的活性,能夠引起胰腺B細胞的減少,進而導致胰島素缺陷型的糖尿病。所以,選擇性的抑制CDK2,而對CDK4不造成影響可能對于發(fā)展療效理想,同時副作用的小的化合物的有效的途徑。最近,研究發(fā)現(xiàn),N-phenylpyrimidin-2-amines類化合物對CDK2有高選擇性,而對CDK4無明顯影響。因此,利用3D-QSAR,同時結(jié)合分子對接、MESP計算、Mulliken電荷分析和分子動力學模擬,研究CDK2和CDK4選擇性抑制劑。實驗結(jié)果表明,疏水基團和氫鍵供體有利于CDK2配體復合物的形成,同時,靜電基團和氫鍵受體有利于CDK4配體復合物的形成。利用3D-QSAR研究CDK2和CDK4與抑制劑作用的不同特點,發(fā)現(xiàn),化合物3A、4B和5B有非常相似的結(jié)構,但是這三個化合物對于CDK2的選擇性分別是CDK4的5000倍、90倍和9倍。分子對接結(jié)果顯示,三個化合物在ATP結(jié)合口袋中,構象類似于V形。除此之外,選擇對CDK2和CDK4抑制活性基本無差別的化合物5B,以及抑制活性最低和化合物化合物26B和27B,計算DFT和MESP。數(shù)據(jù)顯示,MESP分析與3D-QSAR和分子對接的結(jié)果一致。另外,Mulliken電荷分析表明,化合物26B和27B的正負電荷分布與3D-QSAR的結(jié)果不一致�；衔�3A、4B和5B對CDK2有更高的選擇性,通過分子動力學模擬和結(jié)合自由能的分析,研究CDK2選擇性抑制劑的結(jié)構特點。同時,將動力學模擬的結(jié)果與3D-QSAR得到的結(jié)果進行對比分析,進一步進行結(jié)構分析。結(jié)合自由能的降解分析表明,抑制劑主要靠范德華力與CDK2/CDK4相結(jié)合。結(jié)合自由能計算結(jié)果顯示,化合物3A、4B和5B主要通過與Glu8、Ile10、Gly11、Val18、 Ala31、Phe80、Glu81、Phe82、Leu83、Gln85、Asp86、Gln131、Asn132、 Leu134、Ala144和Asp145的相互作用與CDK2相結(jié)合。而與CDK4的結(jié)合主要通過與Ile12、Gly13、Val20、Ala33、Phe93、Glu94、His95、Va196、Gln98、 Asp99、Leu147、Alal57和Asp158的相互作用。同時發(fā)現(xiàn),Gln85、Asp86和Lys89對CDK2的選擇性發(fā)揮至關重要的作用。而抑制劑與CDK4的結(jié)合,主要是與Glu144和Asn145的靜電相互作用。對于化合物3A,與Gln85、Lys89和Asp145的相互作用,對CDK2的選擇性至關重要�；衔�4B主要靠與Lys89、 Asp86和Asp145的相互作用發(fā)揮選擇性�；衔�5B,主要與CDK4中的Glu144側(cè)鏈形成氫鍵相互作用發(fā)揮選擇性,然而,3A和4B與CDK4并沒有該氫鍵相互作用。細胞周期-蛋白依賴性激酶-7是一種轉(zhuǎn)錄激酶,作為CDK家族的特殊成員,在細胞分裂調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有雙重功能。其不僅控制細胞周期來調(diào)節(jié)CDK激酶的活化,也作為常見轉(zhuǎn)錄因子II H (TFIIH)的組成部分參與轉(zhuǎn)錄的輔助調(diào)節(jié)。因此,CDK7的抑制可能導致其它CDK激酶轉(zhuǎn)錄和活化的中斷,包括CDKl和CDK4,而且進一步導致多種毒性反應的發(fā)生。作為CDK家族的一員,CDK7和CDK2具有高度的結(jié)構同源性,只有很少的CDK2抑制劑針對CDK7具有超過30倍的選擇性抑制作用。因此,深入理解CDK2和CDK7的配體特異性識別機制以及配體-受體之間的相互作用,對于亞型選擇性抑制劑的合理設計具有重要意義。最近,2-苯胺-4-(噻唑-5-基)-嘧啶類化合物作為高效CDK2抑制劑對于CDK7具有超過100倍的選擇性抑制作用。在本工作中,我們綜合運用計算分子對接,EasyMIFS,基于結(jié)構的藥效團模擬,基于配體的MESP圖和分子動力學模擬等技術,希望通過對于CDK2和CDK7選擇性結(jié)合具有重要作用的配體-殘基相互作用進行解釋來進一步提高抑制劑的選擇性。我們對三個具有相似化學結(jié)構的2-苯胺-4-(噻唑-5-基)-嘧啶類化合物,包括CP1, CP2和CP3,分別進行了針對CDK2和CDK7的選擇性機制研究。作為CDK2抑制劑,針對CDK7, CP1具有很好的選擇性抑制作用(900倍),CP2具有一般的選擇性抑制作用(70倍),而CP3作為CDK7抑制劑,對于CDK2具有65倍的選擇性抑制作用。首先,我們利用類似甲基探針(CMET)對X-射線共結(jié)晶復合物ATP-CDK2和ATP-CDK7 (PDB編號：1JST,1UA2)的分子作用場(MIFs)進行分析,并對靶蛋白的配體結(jié)合口袋中一些特定子區(qū)域進行了剖析。EasyMIFs結(jié)果表明最適合容納類似甲基探針(CMET)簇區(qū)域主要集中在一小塊子區(qū)域中(Phe80-結(jié)合口袋)。該結(jié)合口袋周圍分布著Ile10, Gly11, Gly13, Val18, Lys33, Val64, Phe80, Glnl31, Asn132, Ala44, Asp145等CDK2氨基酸殘基,總的相互作用能為1622.967 kcal·mol-1。而在CDK7的類似甲基探針(CMET)簇分布區(qū)域(溶劑展開表面積)中主要分布著Glu20, Thr96, Asp97, Glu99, Val100, Lys139, Pro140, Asn141等氨基酸殘基,總的相互作用能為-955.828 kcal·mol-1。因此,我們利用分子結(jié)合技術發(fā)現(xiàn)抑制劑CP1, CP2和CP3通過氨基噻唑環(huán)的疏水作用和范德華力結(jié)合在由CDK2氨基酸殘基構成的Phe80-結(jié)合口袋中。CDK7抑制劑活性最好的抑制劑CP3的哌嗪基團則通過和CDK7氨基酸殘基Thr96, Asp97, Val100之間的范德華力和疏水作用一直延伸到配體結(jié)合口袋的溶劑接觸面。我們也希望通過比較配體的立體和靜電特性以及其在CDK2和CDK7結(jié)合位點的藥效團特征來分析配體的親和性、選擇性。MESP和基于藥效團的分析也有利于理解和合理分析CDK2抑制劑CPl的負電荷對于CDK7選擇性抑制的重要作用。同樣,我們也詳細討論了CP3正電荷對于CDK7選擇性的重要作用。通過分析來源于藥效團模型的基于結(jié)構的化學特征,我們發(fā)現(xiàn)MESP突出顯示的區(qū)域與CDK2活性口袋中關鍵氨基酸殘基Leu83, Asp86, Lys89的作用有直接聯(lián)系,CDK2關鍵氨基酸殘基Met94和Asp97也有相同結(jié)果。另外,CDK7具有疏水性氨基酸殘基Val100,而CDK2具有親水性氨基酸殘基Lys89,因此CDK7和CP1、CP2具有更好的相互作用。同時,由于CDK7的疏水性殘基Va1100能很好的和CP3的哌嗪環(huán)相互作用,CP3具有良好的CDK7抑制活性。而由于CDK2在類似區(qū)域存在氨基酸殘基Lys89,因此CP3的哌嗪基團無法很好地和CDK2結(jié)合。HOMO和LUMO分析也表明化合物CP1具有比CP2和CP3更高的HOMO值,因此CPl能更好地通過給電子和CDK2結(jié)合。作為中等選擇性化合物,CP2具有更高的LUMO值,表明CP2具有更好的電子接受能力。CPl作為活性最好的化合物,其具有比另外兩個抑制劑更高的偶極矩(水相=15.7D,氣相=11.52D)。最后,我們利用配體CP1, CP2, CP3和CDK2及CDK7的復合物進行分子動力模擬。相關配體和復合物的結(jié)合自由能也通過MM/PBSA和MM/GBSA方法進行了計算。結(jié)合自由能的計算和分解結(jié)果表明和CDK2的氨基酸殘基Glu8, Ile10, Glyll, Val18, Ala31, Phe80, Glu81, Phe82, Leu83, Gln85, Asp86, Lys89, Gln131, Asn132, Leu134, Ala144, Asp 145之間的范德華力和靜電作用有利于蛋白和三個抑制劑的結(jié)合。而有利于抑制劑和CDK7結(jié)合的氨基酸殘基包括Ile6, Gly7, Val14, Ala27, Phe79, Asp80, Phe81, Met82, Thr84, Asp85, Val88, Leul32, Alal44, Asp155。結(jié)合自由能分解結(jié)果顯示氨基酸殘基Gln85, Lys89, Asp 145對于CDK2選擇性抑制具有重要作用。和CDK7氨基酸殘基Thr96、Val100的疏水性作用對于CDK7選擇性抑制具有重要作用。另外,我們也利用計算機模擬突變對配體-受體相互作用中的重要氨基酸殘基的影響進行研究。Q85T-CP1復合物中Gln85突變后導致結(jié)合自由能△Gbind(GB)明顯下降(14.12 kcal·mol-1)。由于重要氫鍵的缺失,K89L-CP1復合物中Lys89的突變直接導致結(jié)合自由能bind (GB)只有9.12 kcal·mol-1。更重要的是Gln85和Lys89的突變后形成的靜電作用不利于配體-蛋白結(jié)合(△Gele: 11.23 kcal·mol-1,6.12 kcal·mol-1). D145A-CP1復合物中氨基酸殘基Asp145的突變導致結(jié)合自由能AGbind(GB) (9.21 kcal·mol-1)和范德華作用能(23.12 kcal·mol-1)的減少。盡管CDK2ATP結(jié)合位點的氨基酸殘基Asp145在CDK激酶家族中高度保守,但是我們的計算結(jié)果顯示CDK2氨基酸殘基Asp145可能對于受體的配體識別具有重要作用,而CDK7中的相應氨基酸殘基Asp155對于配體識別則沒有該相同作用。由于蛋白結(jié)合口袋非常相似,因此所謂抑制劑的選擇性是由其中氨基酸殘基的微小空間區(qū)別所引起的。通過比較活化位點,我們發(fā)現(xiàn)CDK2, CDK4, CDK7之間的關鍵氨基酸序列區(qū)別可能對于針對CDK其它亞型選擇性抑制CDK2具有重要作用。CDK2, CDK4, CDK7的ATP結(jié)合域高度保守,在其結(jié)合位點只有非常少的區(qū)別。例如,CDK2在鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基是Leu83,而CDK7在鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基是Va196和Met94。我們通過對CDK2的結(jié)合口袋圖片分析發(fā)現(xiàn)配體3A,4B,5B, CP1, CP2, CP3的嘧啶環(huán)可以和CDK2鉸鏈區(qū)氨基酸殘基Leu83的NH基團形成螯合氫鍵。CDK4和CDK7結(jié)合口袋中也存在相似的情況。CDK2的氨基酸殘基Lys89可以和CDK4的氨基酸殘基Thr102及CDK7的氨基酸殘基Va1100相互疊合,這解釋了化合物3A,4B, CP1, CP2的選擇性。因為化合物3A,4B, CP1, CP2可以和CDK2氨基酸殘基Lys89的側(cè)鏈胺基基團形成氫鍵作用,而在其它CDK4和CDK7的配體-蛋白復合物中則沒有。更重要的是,當CDK2氨基酸殘基Phe82和His84疊合時,在各自蛋白中,CDK2氨基酸殘基His84分別被CDK4氨基酸殘基Asp97及CDK7氨基酸殘基Glu95取代。除此之外,CDK2氨基酸殘基Gln85可以和CDK7氨基酸殘基Thr96相疊合。在各自蛋白中,CDK4的酸性氨基酸殘基Glu144分別被CDK7氨基酸殘基Asnl41以及CDK2氨基酸殘基Gln131所取代。MMGB/PBSA能量分解結(jié)果顯示抑制劑5B和CP3的高抑制活性可能是由于抑制劑分別和CDK4氨基酸殘基Gln144及CDK7氨基酸殘基Asn141形成強相互作用所導致的的。我們通過一系列的分析發(fā)現(xiàn),磺胺基團能提高CDK2抑制劑針對CDK4和CDK7的抑制選擇性。以上發(fā)現(xiàn)也為CDK2選擇性抑制機制的研究提供良好的基礎。盡管如此,CDK2中對抑制劑選擇性具有重要作用的氨基酸殘基仍然需要進一步的研究。由于CDK2選擇性抑制劑良好的研究前景,因此,對于CDK2抑制劑的相關研究有利于發(fā)現(xiàn)更好、選擇性更高、具有類藥性的新型CDK2抑制劑。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96
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本文編號：1644962