本文選題：金納米顆粒　切入點(diǎn)：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的表面透皮給藥系統(tǒng)(Transdemal drug delivery systems TDDS),是指直接在皮膚表面通過涂抹覆蓋的方式給藥,使藥物通過皮膚吸收進(jìn)入皮下,產(chǎn)生全身或局部治療作用的一種新型藥物輸送途徑,屬于無創(chuàng)傷性給藥方式。透皮給藥作為一類特殊的給藥途徑,與傳統(tǒng)的給藥方式(口服和注射)相比,其優(yōu)勢(shì)明顯:1、可以避免藥物在胃酸條件下水解失活,減少與消化酶接觸的機(jī)會(huì);2、可避免肝臟的首過效應(yīng),從而達(dá)到更好的藥物效應(yīng),并減少用藥個(gè)體差異;3、可以隨時(shí)撤銷用藥。如何治療由燒傷或輻射造成皮膚損傷在臨床上仍是一個(gè)棘手的問題。皮膚大面積深度壞損,無法愈合,需要通過植皮以修復(fù)創(chuàng)面。但由于皮下血管的毀壞,植皮后的創(chuàng)面得不到充足的血液供應(yīng)而難以愈合。因此恢復(fù)病灶區(qū)域的血液供應(yīng)是修復(fù)受損皮膚的必要條件。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)由于其特有的高效促血管生成作用,誘導(dǎo)觸發(fā)新的血管的內(nèi)皮細(xì)胞生成,新生血管能恢復(fù)皮膚局部血供,提供表皮和真皮細(xì)胞再生所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),從而促進(jìn)皮膚損傷修復(fù),恢復(fù)屏障功能。然而,傳統(tǒng)給藥的方法不能使VEGF準(zhǔn)確有效地到達(dá)表皮和真皮,且維持其蛋白結(jié)構(gòu),保持原有生物活性。將VEGF通過透皮給藥方式,穿過皮膚的屏障,到達(dá)皮下促進(jìn)血管生成,可能成為有效的治療皮膚損傷的方法。最近,納米粒子(NPs)介導(dǎo)的透皮載藥技術(shù)引起了大量的關(guān)注。其中金納米顆粒作為藥物載體,可以改變膜的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,增加藥物的細(xì)胞膜滲透性,藥物經(jīng)皮吸收后能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。在本文中,我們合成了具有不同表面電荷的金納米顆粒,評(píng)估它們的透皮效率,發(fā)現(xiàn)表面帶負(fù)電荷的金納米顆粒具有高效的透皮效率。VEGF通過生物鏈接金納米顆粒后,其連接合成產(chǎn)物表面仍帶負(fù)電荷。VEGF連接金納米顆粒后,金納米顆粒作為藥物載體可以促使VEGF透過皮膚屏障,進(jìn)入皮下,并維持其生物活性,誘導(dǎo)血管生成。我們的研究結(jié)果可以為皮膚損傷治療提供新的方向。方法1.AuNPs合成方法及AuNPs的表面修飾利用檸檬酸緩沖體系還原制備AuNPs,之后加入SH-PEG-COOH,SH-PEG-NH2和PEG-SH三種不同的聚乙二醇修飾劑,獲得表面有不同官能團(tuán)的金納米顆粒(citrateAuNP,AuNP-PEG-OCH3,AuNP-PEG-COOH和AuNP-PEG-NH2)。2.在體實(shí)驗(yàn)研究AuNPs的透皮效果選用Balb/c小鼠(雌,6~7周),背部剃毛處理,建立動(dòng)物模型。將300μL的不同表面修飾的納米金顆粒(citrate-AuNP、AuNP-PEG-OCH_3、AuNP-PEG-COOH、AuNPPEG-NH_2)溶液(2×10~(10)/mL,1.44μM)滴加在紗布上,覆蓋脫毛處理后裸露的皮膚24 h。然后取皮,制片,用于TEM觀察和銀染處理后觀察。3.MTT試驗(yàn)選擇Balb/c3T3細(xì)胞評(píng)估AuNP-PEG-COOH的細(xì)胞毒性。4.AuNP-PEG-COOH與VEGF的連接AuNP-PEG-COOH調(diào)整濃度為2×10~(11)/mL,利用EDC/sulfo-NHS試劑將VEGF(連接了His標(biāo)簽,濃度為20μg/mL)與AuNP-PEG-COOH連接,得到合成產(chǎn)物AuNPCONH-VEGF。5.在體實(shí)驗(yàn)研究AuNP-CONH-VEGF的透皮效果運(yùn)用上述動(dòng)物模型,在無菌紗布上滴加300μL的AuNP-CONH-VEGF懸浮液,覆蓋裸露皮膚24 h。24 h后,取皮制片,免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)VEGF是否透過皮膚屏障進(jìn)入皮下。同樣動(dòng)物模型,透皮處理7天之后,取皮制片,用免疫組化染色和HE染色,進(jìn)一步研究透皮后的VEGF能否促進(jìn)皮下血管生成。結(jié)果1.檸檬酸鈉還原法合成的AuNPs,AuNPs的直徑約11.2±0.1 nm,為幾何學(xué)球形且呈分散性。修飾后的金納米顆粒,AuNP-PEG-OCH_3(表面電中性),AuNP-PEG-COOH(表面帶負(fù)電荷),AuNP-PEG-NH_2(表面帶正電荷)。2.不同表面修飾的AuNPs透皮處理后,在皮膚表皮層真皮層均均發(fā)現(xiàn)納米金顆粒。TEM圖片只能定性地證明表面帶不同電荷的AuNPs可以透過皮膚屏障進(jìn)入皮下。我們將相同實(shí)驗(yàn)方法下得到的皮膚樣本進(jìn)行sliver-enhanced染色,以對(duì)表面帶不同電荷的AuNPs的透皮效率進(jìn)行探討。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,表面帶負(fù)電荷的AuNPs,即AuNP-PEG-COOH組銀染圖片內(nèi)的銀染顆粒多于其他組。3.在10μM~50μM的濃度范圍內(nèi)AuNPs安全等級(jí)是1,具有較低的細(xì)胞毒性。4.AuNPs與VEGF結(jié)合后(AuNP-CONH-VEGF),表面電荷仍然是負(fù)電荷。5.我們?cè)谕钙ぬ幚?4 h后的小鼠皮膚中,通過免疫組化染色,檢測(cè)到了VEGF,而對(duì)照組未檢測(cè)出。7天后,運(yùn)用免疫組化染色和HE染色,分析統(tǒng)計(jì)血管生成情況,發(fā)現(xiàn)皮膚表面施用AuNP-CONH-VEGF,即實(shí)驗(yàn)組,皮下的血管密度明顯高于對(duì)照組.結(jié)論1.表面帶負(fù)電荷的AuNPs,即AuNP-PEG-COOH,具有最高透皮效率。2.連接了VEGF后的納米金顆粒(AuNP-CONH-VEGF)的表面依舊帶負(fù)電荷。3.使用EDC/sulfo-NHS將AuNP-PEG-COOH與VEGF連接,連接后的VEGF可以直接透過皮膚屏障,進(jìn)入皮下,誘導(dǎo)血管生成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R943;TB383.1

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