本文選題：病毒性心肌炎　切入點：NCC　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是一種心肌疾病,一般是被病毒感染而導致且發(fā)病率非常高,目前常見發(fā)病于兒童和青少年。VMC可以被多種病毒誘發(fā)。如粘病毒、腸道病毒和腺病毒等等。其中,腸道病毒中的柯薩奇B3型病毒(Coxsackievirus B3,CVB3)較為常見。CVB3病毒是無包膜的單鏈RNA病毒,常經(jīng)消化道或呼吸道進入人體并使之感染。病毒性心肌炎在臨床上主要表現(xiàn)為炎性細胞浸潤和心肌細胞的壞死,部分患者的發(fā)病初期沒有明顯癥狀,但隨著病情的持續(xù)發(fā)展,可能出現(xiàn)心律失常、心功能不全、房室阻滯、休克等癥狀,嚴重者甚至猝死。孕婦若感染則能夠發(fā)生非麻痹性脊髓灰質(zhì)炎性病變,使胎兒在子宮內(nèi)受到感染并能導致畸形。VMC現(xiàn)已嚴重威脅著人類的健康,但對于VMC的發(fā)病機制,目前還不明確,臨床上也缺少特效的治療藥物。因此,闡明VMC發(fā)病機制和開發(fā)研制新型特異性的抗病毒性心肌炎藥物是當前的重要任務。NCC是一種新型核苷類似物,在前期研究中已經(jīng)被證實在體外細胞模型中具有很好的抗CVB3活性。本課題成功構(gòu)建病毒性心肌炎體外模型,通過三種不同的給藥方式,探究了藥對CVB3吸附作用的影響、藥對CVB3生物合成的影響以及藥對CVB3的直接作用。通過檢測NCC對CVB3,進一步探討NCC對CVB3感染的宿主細胞凋亡情況的影響并通過RT-PCR和Western-Blot進一步研究NCC抗CVB3的作用機制。方法:1.分別采用先加藥再加病毒,先加病毒再加藥,藥物對病毒直接作用三種不同給藥方式,通過MTT法檢測NCC對CVB3的作用。2.選用CVB3病毒感染對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Hela細胞。然后用流式細胞儀來檢測細胞線粒體膜電位的變化情況;應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測NCC對CVB3 TLR3、TLR7、MDA-5表達水平的影響。通過免疫印跡實驗(Western-Blot)檢測MAPK蛋白水平的變化。結(jié)果:1.成功構(gòu)建CVB3體外細胞模型。TCID50=10-6.32.三種給藥方式結(jié)果:NCC TC50為1.27 m M。計算NCC對CVB3的IC50值,先加藥后加病毒,最后加入培養(yǎng)基的方法:測得IC50值為20.04 m M,TI為0.06;先加病毒后加藥液持續(xù)培養(yǎng)的方法:測得IC50值為25.27μM,TI為50.26;先將病毒與藥液混合2h后加入細胞,再加入培養(yǎng)基的方法:測得IC50值為223.68μM,TI為5.68。3.線粒體膜電位檢測結(jié)果:與病毒對照組相比,NCC作用后,線粒體膜電位均明顯升高(P0.05)。4.RT-PCR檢測結(jié)果:與病毒對照組相比,NCC作用于CVB3感染的Hela細胞后,細胞相關(guān)因子TLR3、TLR7和MDA-5的表達均明顯降低(P0.05)。5.Western-Blot檢測結(jié)果:NCC作用于CVB3感染Hela細胞后,p44/42 MAPK(Erk1/2)的蛋白表達量明顯上調(diào)(P0.05)。結(jié)論:1.NCC抗CVB3的作用可能是影響CVB3的生物合成以及藥物對CVB3具有直接作用。2.NCC抗CVB3的主要機制可能與NCC對CVB3感染導致Hela細胞的凋亡的抑制作用有關(guān),從實驗結(jié)果看出在基因水平上NCC可以抑制相關(guān)因子TLR3、TLR7和MDA-5的表達;而在蛋白水平上可以促進p44/42 MAPK(Erk1/2)的表達。
[Abstract]:Viral myocarditis virus (VMC) is a kind of myocardial disease, which is usually caused by virus infection and has a very high incidence. At present, it is common in children and adolescents. VMC can be induced by many kinds of viruses, such as myxovirus. Among them, Coxsackievirus B3 (Coxsackievirus B3CVB3) is more common. CVB3 virus is a single-stranded RNA virus with no capsule. Viral myocarditis often enters the human body through the digestive tract or respiratory tract and infects it. The clinical manifestations of viral myocarditis are mainly inflammatory cell infiltration and myocardial cell necrosis. Some patients have no obvious symptoms at the initial stage of the disease, but with the development of the disease, Arrhythmia, cardiac insufficiency, atrioventricular block, shock and other symptoms, severe or even sudden death. The fetus is infected in the womb and can cause malformation. VMC is a serious threat to human health, but the pathogenesis of VMC is still unclear, and there is a lack of special therapeutic drugs in clinic. It is an important task to elucidate the pathogenesis of VMC and to develop a novel specific anti-viral myocarditis drug. NCCis is a novel nucleoside analogue. In previous studies, it has been proved that it has good antiviral CVB3 activity in vitro cell model. In this paper, we successfully constructed the model of viral myocarditis in vitro, and explored the effect of the drug on the adsorption of CVB3 by three different ways of administration. The effect of NCC on the biosynthesis of CVB3 and the direct action of NCC on CVB3. The effect of NCC on apoptosis of CVB3 infected host cells and the mechanism of NCC anti-#en8# were studied by means of RT-PCR and Western-Blot. Method 1. Add the drug first and then the virus, Add the virus first and then add the drug. The drug acts directly on the virus in three different ways of administration. The effect of NCC on CVB3 was detected by MTT method. Hela cells were infected with CVB3 virus in logarithmic phase and then the changes of mitochondrial membrane potential were detected by flow cytometry. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the effect of NCC on the expression of CVB3 TLR7MDA-5. Western-Blot assay was used to detect the changes of MAPK protein level. Results: 1. The cell model of CVB3 in vitro was successfully constructed. The IC50 value of NCC to CVB3 was calculated by calculating the IC50 value of NCC to CVB3. The method of adding virus first, then adding virus, finally adding medium: the IC50 value was 20.04 m MNTI was 0.06; the method of continuous culture with virus and drug solution: the IC50 value was 25.27 渭 MN TI was 50.26; the virus was mixed with drug solution for 2 hours and then added into cell. The method of adding culture medium: the IC50 value was 223.68 渭 MN TI 5.68.3. The result of mitochondrial membrane potential detection: compared with the virus control group, the effect of IC50 was higher than that of the control group. The results of RT-PCR analysis showed that compared with the control group, the CVB3 infected Hela cells were treated with NCCs. The expression of TLR3, TLR7 and MDA-5 decreased significantly. 5. Western-Blot analysis showed that the protein expression of p44 / 42 MAPK / Erk1 / 2) in CVB3 infected Hela cells was significantly up-regulated by P0.05. conclusion\\\%\\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%\%? 2. The main mechanism of CVB3 against CVB3 may be related to the inhibitory effect of NCC on the apoptosis of Hela cells induced by CVB3 infection. The results showed that NCC could inhibit the expression of TLR3, TLR7 and MDA-5 at the gene level, while at the protein level, it could promote the expression of p44 / 42 MAPKN Erk 1 / 2.
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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本文編號：1610220