發(fā)布時(shí)間：2018-03-09 21:03

  本文選題：阿爾茨海默病　切入點(diǎn)：阿托伐他汀　出處：《遼寧醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 我們前期研究表明，阿托伐他汀(atorvastatin，Ato)對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白和樹(shù)突生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用，阿托伐他汀也能夠?qū)?淀粉樣蛋白1-42(A1-42)引起的神經(jīng)元突觸損傷具有保護(hù)作用，但作用機(jī)制不清楚。本研究進(jìn)一步觀察阿托伐他汀對(duì)Aβ1-42寡聚物(AβOs)引起的神經(jīng)元損傷是否具有保護(hù)作用并探討其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 方法 AD大鼠模型的建立，SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只即正常對(duì)照組、Aβ1-42損傷組、Ato+Aβ1-42組、單獨(dú)Ato組。連續(xù)用Ato灌胃3周后，Aβ1-42損傷組和Ato+Aβ1-42組腦室內(nèi)恒速注射Aβ1-42寡聚物(1mmol·L-1)5μl，正常對(duì)照組、單獨(dú)Ato組腦室內(nèi)恒速注射等量生理鹽水。腦室注射24h后進(jìn)行大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，大鼠連續(xù)訓(xùn)練8d，第9d進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)期間繼續(xù)給藥。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物麻醉狀態(tài)下，生理鹽水灌流后斷頭取腦，快速分離海馬組織，-80℃凍存?zhèn)溆谩estern blot印跡法檢測(cè)大鼠海馬組織內(nèi)突觸素（SYP）、突觸后致密蛋白95（PSD-95）、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（p-p38MAPK）蛋白表達(dá)量；應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠海馬組織炎癥因子白介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含的改變。 大鼠腦微透析實(shí)驗(yàn)分組，40只SD大鼠，隨機(jī)分為五組：生理鹽水對(duì)照組、A1-42損傷組、單獨(dú)Ato組、Ato+A1-42治療組、Ato灌胃+A1-42治療組，每組8只。10%水合氯醛腹腔(0.3mL·l00g-1)麻醉后，分別于左側(cè)腦室和右側(cè)海馬植入透析套管，牙科水泥外固定。24h后，大鼠在清醒狀態(tài)下進(jìn)行腦微透析實(shí)驗(yàn)，每30min收集1管透析液。取前3管透析液作為基礎(chǔ)值。生理鹽水組大鼠腦室恒速注射5μL生理鹽水；損傷組大鼠恒速注射A1-42(1mmol·L-1)5μL；單獨(dú)Ato組注射Ato (2.5μg·μl-1)3μl；Ato+A1-42治療組先注射Ato3μl，30min后再注射A1-42(1mmol·L-1)5μL；Ato灌胃+A1-42治療組，Ato灌胃兩周后植入透析套管，左側(cè)腦室恒速注射A1-42(1mmol·L-1)5μL，每次透析前Ato灌胃；連續(xù)收集透析液至96h后。收集透析液隨即應(yīng)用高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法(HPLC-ECD)測(cè)定所收集透析液中去甲腎上腺素（NE)，腎上腺素（EP），五羥色胺（5-HT），5-羥吲哚乙酸（5-HIAA)的含量。 體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，取0~24h的SD大鼠乳鼠，無(wú)菌條件剝離大腦分離海馬組織，剪碎-消化后置于DMEM/F12培養(yǎng)基中37C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組；A1-42(20、50、100nmol·L-1)處理組；A1-42+Ato (1、2.5、5) μmol L-1組。正常對(duì)照組，培養(yǎng)7d神經(jīng)元加入0.1%的DMSO作用48h；A1-42處理組：培養(yǎng)7d神經(jīng)元加入50nmol·L-1的A1-42作用48h；A1-42+Ato組：培養(yǎng)7d神經(jīng)元加入Ato作用1h，再加入A1-4250nmol·L-1的共同作用48h。應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)改變，免疫熒光染色觀察微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)、SYP表達(dá)的改變，Westernblot印記法檢測(cè)SYP、PSD-95、 p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)染色和Western Blot印跡法分析顯示本研究應(yīng)用的AβOs主要由Aβ二聚體(約8kDa)和Aβ單聚體組成。我們應(yīng)用ELISA方法測(cè)定了腦室內(nèi)注射AβOs后24h和9d海馬內(nèi)Aβ含量，結(jié)果顯示，腦室內(nèi)注射Aβ后能導(dǎo)致海馬內(nèi)Aβ量較注射生理鹽水組明顯升高，證明了腦室內(nèi)注射的Aβ能到達(dá)海馬。 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AβOs損傷組大鼠找到平臺(tái)所需時(shí)間較生理鹽水對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，大鼠在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比及穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯低于生理鹽水對(duì)照組， Ato+Aβ1-42組大鼠找到平臺(tái)所需時(shí)間明顯短于AβOs損傷組，在原平臺(tái)象限百分比及穿越平臺(tái)次數(shù)明顯高于AβOs損傷組。Western Blot印跡法檢測(cè)大鼠海馬和體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元SYP和PSD-95蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，腦室內(nèi)注射AβOs后9d，海馬SYP和PSD-95蛋白表達(dá)較生理鹽水對(duì)照組明顯降低。應(yīng)用培養(yǎng)海馬神經(jīng)元模型也顯示AβOs能劑量依賴性的降低SYP和PSD-95蛋白表達(dá)水平，Ato能明顯對(duì)抗AβOs引起的大鼠海馬和體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的SYP和PSD-95蛋白表達(dá)水平的降低，進(jìn)一步證明了Ato對(duì)Aβ引起的突觸損傷有明顯的保護(hù)作用。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β、TNF-α、IL-6的含量，結(jié)果表明腦室內(nèi)注射AβOs后能使大鼠海馬IL-1β、TNF-α、IL-6含量較生理鹽水對(duì)照組明顯增加，Ato能明顯抑制AβOs引起的這些細(xì)胞因子的增加。為了探討Ato產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，我們觀察了海馬和培養(yǎng)海馬神經(jīng)元p-p38MAPK表達(dá)的改變，結(jié)果顯示腦室內(nèi)注射AβOs使海馬p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加，，應(yīng)用AβOs處理培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，也能使p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯增加，Ato處理能明顯對(duì)抗AβOs引起的p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平的增加。應(yīng)用p38MAPK特異性阻斷劑SB203580也能抑制AβOs引起的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的SYP和PSD-95蛋白表達(dá)水平的降低，說(shuō)明AβOs引起的突觸損傷與p38MAPK信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)。 SD大鼠腦微透析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，側(cè)腦室內(nèi)注射AβOs組大鼠給藥后24h和48h后海馬內(nèi)NE、EP含量明顯增加，但給藥后72h和96h后NE的含量明顯下降，而EP的含量持續(xù)上升。在注射AβOs前腦室注射阿托伐他汀能對(duì)抗AβOs引起的NE的改變，也能部分對(duì)抗AβOs引起的EP含量的增加。此外，腦室內(nèi)注射AβOs48h能引起海馬5-HT和5-HIAA的水平明顯降低，其作用一直持續(xù)到注射后96h，在注射AβOs前腦室注射阿托伐他汀能對(duì)抗AβOs引起的5-HT和5-HIAA水平的降低。灌胃給予阿托伐他汀產(chǎn)生的作用與側(cè)腦室注射給藥作用相似。 結(jié)論 1、阿托伐他汀可以明顯改善AβOs引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙； 2、阿托伐他汀對(duì)抗AβOs引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷與對(duì)抗AβOs引起的突觸損傷有關(guān)； 3、阿托伐他汀能對(duì)抗AβOs引起的海馬單胺類遞質(zhì)釋放的改變； 4、阿托伐他汀產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制p-p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而抑制AβOs引起的炎癥反應(yīng)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R966

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉卓;隋海娟;閆恩志;劉婉珠;金英;;知母皂苷對(duì)脂多糖引起星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響及機(jī)制[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2012年07期

本文編號(hào)：1590246