本文選題：激活素受體樣激酶　切入點(diǎn)：Bac　出處：《中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志》2017年06期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的構(gòu)建適于高通量篩選的激活素受體樣激酶4(ALK4),ALK5和ALK7抑制劑的篩選模型。方法利用Bac to Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建ALK4激酶結(jié)構(gòu)域(ALK4kd),ALK5kd和ALK7kd及Smad2和Smad3蛋白的病毒表達(dá)系統(tǒng),轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞,表達(dá)目的蛋白;通過谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)親和柱純化,獲得純化的目的蛋白;分別以純化的ALK4,ALK5,ALK7激酶片段與純化的Smad3和ATP構(gòu)建ALK4,ALK5,ALK7激酶活性測定體系,優(yōu)化各反應(yīng)底物濃度及反應(yīng)條件,建立適于通量化分析的篩選模型;以已知ALK激酶抑制劑SB431542為工具分子,檢測其對激酶的抑制活性,確證篩選模型的可靠性。結(jié)果經(jīng)酶切和PCR鑒定,所得重組Bacmid均正確。轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后純化獲得相應(yīng)目的蛋白。經(jīng)條件優(yōu)化,反應(yīng)體系中激酶和底物蛋白Smad3最佳濃度均為10 mg·L~(-1),ATP最佳初始濃度為10 nmol·L~(-1)。所得ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制劑篩選體系的Z′因子分別為0.71,0.51和0.74,符合高通量篩選要求。已知SB431542在所建模型上對ALK4kd,ALK5kd和ALK7kd的抑制活性IC50值分別為22,188和91 nmol·L~(-1)。結(jié)論成功構(gòu)建了ALK4,ALK5和ALK7激酶抑制劑的體外篩選模型。
[Abstract]:Objective to construct an ALK5 and ALK7 inhibitor screening model suitable for high throughput screening. Methods using the Bac to Bac baculovirus expression system, the viral expression systems of ALK4 kinase domain ALK4kd, ALK7kd, Smad2 and Smad3 proteins were constructed. Transfection of Sf9 insect cells, expression of target protein, purification of purified target protein by glutathione S-transferase (GST) affinity column, and construction of ALK4, ALK5, ALK7 kinase activity assay system with purified Smad3 and ATP, respectively. By optimizing the concentration and reaction conditions of each substrate, a screening model suitable for quantitative analysis was established, and the inhibitory activity of SB431542, a known inhibitor of ALK kinase, was tested. Results the recombinant Bacmid was confirmed by restriction endonuclease digestion and PCR. The target protein was purified by transfection of Sf9 insect cells. The optimum initial concentration of kinase and substrate protein Smad3 was 10 nmol 路L ~ (-1). The Z' factor of ALK4 / ALK5 and ALK7 kinase inhibitor screening system were 0.71 and 0.74, respectively, which met the requirement of high throughput screening. The results showed that the best initial concentration of SB431542 was 10 nmol 路L ~ (-1). The results showed that the best initial concentration of Smad3 was 10 nmol 路L ~ (-1), and the Z' factor of ALK4 / ALK5 and ALK7 kinase inhibitor screening system were 0.71 and 0.74, respectively. The inhibitory activity IC50 values of ALK4kd and ALK7kd were 22,188 and 91 nmol 路L ~ (-1), respectively. Conclusion the in vitro screening model of ALK4 / ALK5 and ALK7 kinase inhibitors was successfully constructed.
【作者單位】： 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所;抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81430090) 國家科技重大專項(xiàng)(2009ZX09501031);國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX09301-003003)~~
【分類號】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳蓉;謝梅林;;TGF-β/Smads信號通路在心肌纖維化發(fā)生和治療中應(yīng)用前景的研究進(jìn)展[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2012年09期

【共引文獻(xiàn)】

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2 韓安邦;張健;路迎冬;趙明鏡;趙一舟;何姚姚;崔向?qū)?;芪藶強(qiáng)心膠囊對心肌梗死大鼠心肌纖維化及TGF-β_1/Smad3信號通路的影響[J];北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2017年01期

3 王今越;;轉(zhuǎn)化生長因子β信號與肌肉調(diào)控[J];中國組織工程研究;2016年33期

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6 聶丹;孫紅丹;時召平;周曉慧;;丹皮酚、三七總皂苷組方對心肌梗死后心室重構(gòu)大鼠TGF-β/Smads信號通路的影響[J];天津醫(yī)藥;2016年04期

7 鄭亞萍;王興紅;;腺病毒siRNA沉默Raf-1基因抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2015年23期

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9 林琳;鄭晶;朱偉平;;ILK介導(dǎo)TGF-β/Smad通路誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2015年28期

10 劉紫東;張志;付偉;林朵朵;;前列地爾對糖尿病大鼠心功能的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制[J];中國動脈硬化雜志;2015年06期

【二級參考文獻(xiàn)】

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1 孫紅霞;楊世杰;;依那普利抗異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化作用及機(jī)制[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2009年08期

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3 張遠(yuǎn)強(qiáng),胡靜,劉新平,許若軍;EXPRESSION AND LOCALIZATION OF SMAD4 PROTEIN IN RAT TESTIS DURING THE POSTNATAL DEVELOPMENT[J];Chinese Medical Sciences Journal;2003年03期

4 徐新保,冷希圣,何振平,梁志清,林凱,魏玉華,于鑫,彭吉潤;Inhibitory effect of retroviral vector containing anti-sense Smad_4 gene on Ito cell line, LI90[J];Chinese Medical Journal;2004年08期

5 鄭啟新;王運(yùn)濤;郭曉東;;Wild-type Smad3 Gene Enhances the Osteoblastic Differentiation of Rat Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells in Vitro[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2005年06期

6 王運(yùn)濤,鄭啟新,郭曉東,吳永超,郝杰;Influence of Exogenous TGFβ_1 on the Expression of Smad2 and Smad3 in Rat Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2005年01期

7 ;HSP70 decreases receptor-dependent phosphorylation of Smad2 and blocks TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition[J];遺傳學(xué)報(bào);2011年03期

8 ;Berbamine inhibits proliferation and induces apoptosis of KU812 cells by increasing Smad3 activity[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2011年07期

9 尚政軍;修復(fù)相關(guān)基因Smad3的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);2001年05期

10 楊曉 ,孫彥洵 ,周江 ,黃培堂 ,黃翠芬 ,徐曉玲 ,李翠玲 ,GotayJessica ,陳林 ,鄧初夏;Establishment of murine Smad5 double knockout ES cells and the studies on their properties[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2001年02期

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2 張素平;張然;陳峰;張麗霞;陳曄光;;Smad7 antagonises TGF-β signaling in the nucleus[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會2005年學(xué)術(shù)大會、青年學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2005年

3 王劍;楊曉;;Gene expression profile in cardiomyocyte-specific Smad4 knock-out mice[A];中國遺傳學(xué)會第八次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

4 劉昭廷;王強(qiáng);孟安明;;基因組水平上受斑馬魚Smad2調(diào)控的靶基因[A];“細(xì)胞活動 生命活力”——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會全體會員代表大會暨第十二次學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2011年

5 ;HSP70 decreases receptor-dependent phosphorylation of Smad2 and blocks TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition[A];“細(xì)胞活動 生命活力”——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會全體會員代表大會暨第十二次學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2011年

6 ;Maternal Smad3 Deficiency Compromises Decidualization in Mice[A];“細(xì)胞活動 生命活力”——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會全體會員代表大會暨第十二次學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2011年

7 Jingmin Zhao;Jia Wang;Jun Yu;;Inhibitory role of Smad7 in hepatocarcinogenesis in mice and in vitro[A];中華醫(yī)學(xué)會第十六次全國病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

8 Bensoussan D.;Stoltz J.F.;de Isla N;;Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells induced by biaxial tension involves Smad3 activation[A];中國生理學(xué)會第23屆全國會員代表大會暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會論文摘要文集[C];2010年

9 ;Function of TGF-β/Smad4 Signaling in the Maintenance of Tissue Homeostasis[A];中國的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進(jìn)步推動中國西部經(jīng)濟(jì)與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學(xué)會大會論文摘要匯編[C];2011年

10 楊曉;;Targeted disruption of Smad4 in mouse epidemis results in failure of hair follicle cycling and formation of skin tumors[A];中國遺傳學(xué)會七屆一次青年研討會暨上海高校模式生物E——研究院第一屆模式生物學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2005年

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1 記者 李天舒;先天性心臟病病因被發(fā)現(xiàn)[N];健康報(bào);2009年

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本文編號：1577273